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    不同氧化鋁噴砂—酸蝕親水性純鈦表面細胞粘附反應

    時間:2015-11-20 來源:未知 作者:小韓 本文字數:3715字

      表面特性包括表面微形貌、化學能、潤濕性及自由能等,影響蛋白吸附水平從而影響細胞粘附。大量體外研究對不同細胞在材料表面的細胞行為學比較,均顯示了根據表面性能不同所表現出不同的細胞學反應。本研究通過對細胞粘附過程各時間點細胞形態進行掃描電鏡觀察以及通過核熒光染色計算粘附率,比較評估不同氧化鋁噴砂-酸蝕( sandblast-ed alumina acid-etched,SAA) 親水性純鈦表面細胞粘附反應。

      1 材料和方法

      1. 1 材料制備和分組

      醫用純鈦( 陜西寶雞有色金屬工業公司) 經機械加工為直徑 12 mm、厚 2 mm 的圓盤試件,由直徑100 ~ 200 μm、200 ~ 300 μm 及 300 ~ 400 μm 的Al2O3顆粒噴砂、相同條件下恒溫酸蝕處理分別得到SAA 表面的 3 個處理組: A 組、B 組和 C 組; 對照組為未處理的鈦片打磨拋光得到光滑鈦片。制備 4 組試樣,每組 50 個,所有試樣經丙酮、無水乙醇及去離子水超聲清洗后,生理鹽水儲存,γ 射線( 25. 0 kGy,12 h) ( 華大輻照中心提供) 消毒備用。各組隨機抽取 6 個,表面形貌儀測量表面粗糙度( Ra) .

      1. 2 表面靜態水接觸角檢測

      采用光學接觸角測量儀座滴法測定計算蒸餾水在鈦片表面靜態水接觸角,并采用連續聚焦放大變焦透鏡記錄水滴在各處理組材料表面接觸瞬間照片。

      1. 3 細胞接種培養及掃描電鏡觀察

      將消毒后的 4 組鈦片置于 24 孔培養板內,將人成骨肉瘤細胞系 MG63 以 1 × 104個/cm2的濃度接種于處理鈦片表面,培養 2 h、4 h、8 h 取出鈦片。掃描電鏡下觀察各組各時間點的細胞形態。

      1. 4 4 組鈦片表面細胞核熒光染色及計數

      將 MG63 接種于鈦片表面,方法及密度同 1. 3,培養 2 h、4 h、8 h 后吸出培養液,沖洗,3. 7% 多聚甲醛固定,沖洗,加入 0. 1%Triton X-100 裂解,沖洗,加入 Hoechst33342( Invitrogen,美國) ( 1∶ 10 000 稀釋)避光染色 20 min 甘油封片。在熒光顯微鏡下攝片,使用圖像軟件分析計數。粘附率 = 粘附細胞量/接種細胞量 ×100%.

      1. 5 統計學分析

      以上每個時間段每組均為 6 個樣本量,每個樣本重復測量 3 次。采用 SPSS 13. 0 統計學軟件分析數據,多個樣本均數比較采用單因素方差分析,方差齊則采用 LSD 樣本均數間的兩兩比較,方差不齊則采用 Welch 方法進行方差分析后,Dunnett's T3 多重比較,P <0. 05 為差異有統計學意義。

      2 結 果

      2. 1 表面粗糙度及表面靜態水接觸角結果

      對照組、A 組、B 組和 C 組表面粗糙度( Ra) 分別為( 0. 27 ± 0. 11) μm、( 1. 69 ± 0. 05) μm、( 2. 08 ±0. 11) μm和( 2. 55 ± 0. 20) μm,兩兩比較 Ra 值差異具有統計學意義( P <0. 05) .表面靜態水接觸角的測量結果如表 1 所示,3 個處理組潤濕性良好,對照組較差( 圖 1) .

      方差分析比較 4 組間整體差異具有統計學意義( F = 1 900. 164,P < 0. 001) ; 對照組分別與 A、B、C3 組差異具有統計學意義( P < 0. 001) ,A、B、C 3 組兩兩比較差異無統計學意義( P >0. 05) .
      
      2. 2 掃描電鏡觀察 4 組鈦片 MG63 粘附情況

      4 組鈦片接種 MG63 后 3 個時間段粘附、伸展的形貌如圖 2 所示。4 組細胞在接種 2 h 時均發生粘附; 3 組處理組細胞多數呈球形,細胞直徑約為10 μm,粘附于大孔洞內,對照組細胞在鈦片上鋪展開,5 000 倍掃描電鏡下觀察各組細胞2 h 粘附情況,可見處理組與對照組細胞粘附的位點之間存在差異( 圖 3) ,以及 3 個處理組之間大凹坑樣結構與細胞的相對大小不同,并且細胞已經與材料表面接觸同時發生了形態學變化。3 000 倍掃描電鏡觀察,可見4 h 時,對照組細胞沿溝紋方向伸展,并向周圍細胞伸出突觸; 3 個處理組細胞在大孔洞內向孔洞隆起的邊嵴伸出突起,A 組和 B 組較 C 組先伸出指狀突觸( 圖 3) .8 h 時,各組細胞已經開始呈現明顯的多角形、梭形。比較各組圖像得出,細胞呈時間規律性地發生粘附和伸展。對照組細胞較早發生粘附和伸展,細胞呈平鋪薄層狀平行排列; 處理組細胞伸展相對于對照組更立體,胞漿豐富,表面偽足突起更多,細胞間連接更加廣泛。處理組中,A 組、B 組伸展情況優于 C 組。

      2. 3 鈦片上細胞熒光顯微鏡下粘附率的比較

      4 組鈦片各時間段的粘附率見表 2,各組細胞粘附率都呈現了時間依賴性,隨著時間的增加粘附率上升。經析因方差分析,處理組不同時間段間差異有統計學意義( F =2 301. 489,P <0. 001) ; 不同處理組間差異有統計學意義( F =95. 449,P <0. 001) ; 不同時間段與不同處理組兩因素間有交互作用( F =31. 131,P < 0. 001) .

      2 h 時,對照組高于處理組,對照組與處理組差異均有統計學意義( P < 0. 001) ,3 個處理組兩兩之間差異均無統計學意義。4 h 時,4 組間差異有統計學意義( P <0. 05) ,對照組低于處理組( P < 0. 05) ,3 個處理組兩兩之間差異均無統計學意義。8 h 時,4 組間差異有統計學意義( P < 0. 05) ,對照組低于處理組( P < 0. 05) ,對照組與處理組差異均有統計學意義( P <0. 05) ,A 組和 B 組之間差異無統計學意義; C 組與 A 組和 B 組差異存在統計學意義( P <0. 05) ,C 組低于 A 組和 B 組。
      
      3 討 論

      Wennerberg 系統性回顧體內試驗的研究得出,中度粗糙也就是粗糙度在 1 ~2 μm 的表面得到最佳的骨整合,而單一的粗糙度并不能作為種植體的評價標準[1].由 80 年代開始,隨著生物材料的發展,研究越來越多的集中在表面化學能、比表面能( 如表面張力、表面自由能等) 和表面微形貌的關系和影響細胞反應的重要因素上。成骨細胞與材料的相互反應依賴于這些材料表面特征,它們決定了生物分子如何吸附到表面上,并且決定了吸附分子取向性,細胞接觸時的行為; 而粘附過程取決于最先吸附的粘附蛋白。作為細胞與材料接觸的第一步,成骨細胞粘附是促進分泌胞外基質蛋白、誘導無機成分沉積,調控骨組織形成、吸收、改建的基礎[2].粘附行為將影響細胞的形態以及細胞增殖分化的能力[3],表面越粗糙,比表面積越大,表面能也越高,表面羥基團越多,這可在鈦表面產生更多的表面活性點和更高的熱力學反應潛力,吸附更多的纖連蛋白大分子[4].

      多項研究證明具有微米或納米結構的表面微結構,其親水性能在增強細胞反應過程中發揮了重要作用,從而獲得更強的細胞分化能力和成骨細胞產生局部因子的能力[5-6].生物材料在植入人體后先與體液相接觸再與體液中的組織細胞相接觸。材料潤濕性愈好,親水性愈高,體液在材料表面鋪展滲潤性愈好,分子間反應面積愈大,血液和體液細胞在材料表面接觸機會愈多,愈利于細胞的緊密附著,界面的細胞親和性愈強。體外研究顯示了親水性改良大顆粒噴砂酸蝕表面在接觸全血時凝結血小板從而加快凝血塊的形成[7].多項研究認為一定范圍內的粗糙度增加能使材料比表面積增大,從而表面活性反應位點增多、局域內電荷密度提高、極性分量增大,都有利于細胞表面極性分子配體蛋白的吸附反應,從而促進細胞粘附; 但同時表面粗糙度的變化影響著潤濕性改變甚至下降,所以只有當粗糙度和潤濕性達到良好匹配性時材料表面才有利于發揮良好的促細胞黏附效應[8-10].組織工程支架材料領域的研究一般認為細胞在中等潤濕的材料表面粘附能力最強[11].研究認為表面潤濕性可間接表征材料表面能,高能材料表面生物大分子物質更易吸附,彎曲變形、增加附著點,并形成很好的細胞附著前體物,因此有利于生物附著[12].

      本研究處理組鈦片經噴砂酸蝕處理后生理鹽水中儲存,經過 γ 射線( 25. 0 kGy,12 h) 輻照消毒以保持該處理后的親水活性表面,過程中避免空氣中暴露的時間。處理組靜態水接觸角接近零,與單純的噴砂酸蝕表面靜態水接觸角相比,顯示了改良親水性表面潤濕性的變化。本實驗粘附率結果顯示2 h 時對照組高于處理組,除去潤濕性和粗糙度等原因,在研磨拋光鈦表面上可形成接觸誘導加快成骨細胞粘附,而且表面越粗糙,表面的溝槽和峰嵴越明顯,成骨細胞也越容易形成接觸誘導從而引起成骨細胞更快附著[13].有研究顯示光滑鈦片早期粘附高于噴砂-酸蝕表面[13-14].而 4 h、8 h 時處理組粘附率高于對照組。Bigerelle[15]認為,拋光表面不能提供所需的間斷特征或提供的間斷特征的幅值、頻率太小以至于不允許細胞取向或不適于粘附。處理組因其潤濕性高及粗糙程度適中介導了成骨細胞更多的附著。這一點可能在早期與對照組的接觸誘導作用相比表現的不明顯,在4 h 后反應較明顯。本實驗結果顯示 8 h 時 C 組粘附率低于 A 組和 B 組。粗糙度更大的表面、表面不規則度較大、分維數大、表面熱力學分布不均等不利于蛋白和細胞的接觸,最終導致 C 組較中度粗糙的 A、B 組的粘附率低。

      本實驗中,2 h 時可見處理組細胞均呈圓形或橢圓形,而對照組細胞呈平鋪狀。細胞在對照組光滑鈦表面發生取向性生長,而在處理組表面發生無取向性生長。細胞在材料表面生長取向受材料表面形貌調控,對照組細胞取向性生長為溝槽的導向性所致。處理組 4 h 時伸出突起,8 h 時立體伸展明顯;然而對照組一直呈現為薄薄的單層。掃描電鏡結果展現了不同粗化表面決定了細胞粘附后的形態。

      Boyan[16]研究證明,一定的粗糙表面使附著的成骨細胞伸出偽足跨過突起的峰嵴,形成懸吊的橋梁結構,而光滑表面附著的成骨細胞扁平伸展。本研究粘附率結果與掃描電鏡結果結合,親水性中度粗糙表面的 A 組、B 組細胞表現了良好的粘附及伸展形態以及較高的粘附率,反映了該表面特性可能更利于細胞的粘附。良好的潤濕性和中度粗糙表面,更有利于發揮良好的促細胞粘附效應。

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