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    低溫保護劑滲透關節軟骨的實驗研究和數學建模

    時間:2015-09-06 來源:未知 作者:小韓 本文字數:5669字

      引言

      玻璃化保存生物材料可以避免冰晶形成帶來的直接危害( 如細胞膜破裂) 和間接危害( 如電解質濃縮導致蛋白質變性) ,是低溫保存生物材料、建立生物樣品庫的理想選擇。關節軟骨的玻璃化保存研究具有兩個方面的重要意義: 一是軟骨移植是臨床上修復、重建和替換受損關節軟骨的有效手段。

      捐獻的軟骨若能長期保存,那么外科醫生將可針對病變部位挑選合適的移植物,并且有充裕的時間進行多項檢測,以防止供者可能帶來的病毒或細菌感染。這不僅有助于提高軟骨移植手術的成功率,而且使得軟骨移植手術的廣泛開展成為可能。二是關節軟骨僅由單一的軟骨細胞和軟骨基質構成,不含血管、神經和淋巴管,被認為是研究生物組織玻璃化保存的理想對象。關節軟骨的成功保存對低溫保存從細胞水平跨越到體積更大、結構更復雜的組織層面具有重要意義。

      Song 等最早報道了玻璃化保存關節軟骨的較為成功的案例---采用玻璃化溶液 VS55( 含二甲亞砜、甲酰胺和丙二醇,55 表示低溫保護劑總濃度,單位%( W/V) ) 以及特定的步驟,對較薄的兔關節軟骨實施了玻璃化保存并進行移植試驗[1].Pegg 等提出了一邊降低溫度、一邊提高低溫保護劑濃度并始終使溫度略高于組織凍結點的新方法( liquidus-tracking method) 來實現玻璃化[2].該方法的最大優點是不需要快速冷卻和升溫,不足是低溫保護劑溶液處理軟骨樣品的時間很長,且操作步驟繁瑣。

      Pegg 等也曾嘗試 Song 等的保存方案,但發現某些技術環節難以復制。Guan 等嘗試將經過 VS55 處理的牛關節軟骨直接投入液氮,發現快速冷卻對保護軟骨細胞及軟骨基質具有積極作用,但方案的諸多環節有待優化[3].Brockbank 等比較了 VS55 和 VS83玻璃化保存豬關節軟骨的效果,發現在相同保存步驟下濃度較高的 VS83 更適合較厚的豬關節軟骨,但如此高濃度的 VS83 溶液的毒性不可忽視[4].Jomha 等對影響玻璃化保存的多個因素進行研究,從而優化保存方案,對人關節軟骨進行了較為成功的玻璃化保存---軟骨細胞存活率約 75%,可基本滿足臨床移植要求,但仍待進一步提高[5].國內的胥義等則采用動態熱機械分析法,研究關節軟骨力學性能的低溫損傷機理,為關節軟骨保存方案的優化提供力學依據[6 -8].盡管目前對關節軟骨玻璃化保存的研究已有了相當多的成果,但如上所述,保存方案大多或多或少地存在這樣或那樣的缺陷與不足。為了完善關節軟骨玻璃化保存技術,相關的基礎問題仍需要深入研究[9].玻璃化保存關節軟骨的一般流程如圖 1 所示,其中的關鍵是: 在保證對軟骨細胞造成的損傷最小的前提下,將足夠多的低溫保護劑載入軟骨組織,以避免在后續的冷卻和升溫步驟中形成冰晶。低溫保護劑雖能在低溫下對軟骨細胞起保護作用,但卻極易在加載處理過程中對軟骨細胞造成毒性損傷,這種毒性損傷與低溫保護劑的種類、濃度、加載處理溫度和時間均密切相關[10 -11].因此,深入了解低溫保護劑滲透( permeate) 關節軟骨的特性,對合理設計加載處理程序非常重要。筆者對低溫保護劑滲透關節軟骨過程的實驗研究和數學建模兩方面的進展進行了較為詳細的評述,并對今后的研究方向提出了展望。
      
      1 實驗研究

      根據所采用的低溫保護劑定量分析方法的不同,實驗研究低溫保護劑滲透關節軟骨一般可采用兩種路線,如圖 2 所示[12].實驗步驟大致如下: 首先是采用合適的工具( 如角膜環轉) ,在關節的負重部位獲取所需大小的軟骨樣品,用緩沖溶液( 如PBS) 漂洗并擦干后,將其置于事先配制好的一定溫度和濃度的低溫保護劑溶液中浸滲處理指定的時間。一種路線,如果是對低溫保護劑進行組織原位定量分析( 如采用磁共振成像( MRI) ) ,則將浸滲處理過的軟骨樣品快速漂洗并擦干,再放于相應儀器中測量( 圖 2 中路線 2) ; 另一種路線,將浸滲處理過的軟骨樣品快速漂洗并擦干,然后置于一定量的純水中并放置足夠長的時間,使得其中的低溫保護劑可以充分反滲出來,再采用合適的方法( 比如高效液相色譜( HPLC) ) ,對所得反滲液中的低溫保護劑進行定量分析( 圖 2 中路線 1) .如此重復,不管選用哪種路線,最終都可以得到滲入軟骨樣品的低溫保護劑的量隨時間的變化關系。實驗采用的軟骨樣品可以是不帶軟骨下骨( subchondral bone) 的軟骨片( cartilage disc) ,也可以是帶軟骨下骨的骨軟骨栓( osteochondral dowel) .已有研究表明,低溫保護劑在這兩種樣品中的擴散特性并無顯著差別.到目前為止,研究者已經提出和采用多種不同的低溫保護劑定量分析方法,研究了低溫保護劑滲透關 節 軟 骨 的 過 程。在 路 線 1 中,核 磁 共 振( NMR)[15 -17]和高效液相色譜( HPLC)[18]是經常采用的低溫保護劑定量分析方法; 而路線 2 中的典型定量手段是磁共振成像( MRI) ,如 Carsi 等采用 MRI分別研究了二甲亞砜和甘油在人關節軟骨中的擴散[19].MRI 技術可以對軟骨樣品中的低溫保護劑進行組織原位定量分析,不僅可以獲得一個總的濃度,還可以知道低溫保護劑在組織中的空間分布情況,并進而獲取軟骨組織的各向異性對擴散的影響信息。Abazari 等就采用 MRI 技術,首次實驗得到了二甲亞砜在豬骨軟骨栓中的時空分布情況。他們的數據表明,軟骨組織的各向異性對二甲亞砜擴散的影響很小,且二甲亞砜無法從軟骨樣品的骨側滲入[20].不管是 MRI 還是 NMR 或 HPLC,均存在所需設備昂貴、操作復雜的缺點。于是,有研究者提出了滲透壓儀法,即采用滲透壓儀測得反滲液的質量滲摩爾濃度( osmolality,是指在 1kg 溶劑中所溶解的具有滲透作用的微粒的量,單位為 Osm·kg- 1或osmol·kg- 1) ,再經過換算以得到所要的濃度。

      Sharma 等[11]和 Jomha 等[21]分別采用該方法,得到了二甲亞砜、丙二醇、乙二醇和甘油滲入豬軟骨樣品的量隨時間的變化數據。有研究者也通過測量洗脫液的質量滲摩爾濃度,確定除去軟骨樣品中的低溫保護劑所需的時間[22].筆者所在研究小組也采用滲透壓儀法,實驗研究了二甲亞砜對羊關節軟骨的滲透性[23].另外,還依據二甲亞砜分子的特性---含有亞砜基團( - SO - ) 這一硫基生色團,提出可采用紫外吸收光譜法對反滲液中的二甲亞砜進行定量[24].

      低溫保護劑對生物材料的毒性是與溫度密切相關的---溫度越低,毒性越小。Pegg 等提出一邊降低溫度、一邊提高二甲亞砜濃度并始終使溫度略高于組織凍結點的方法,在玻璃化保存羊關節軟骨上獲得了較大成功[2].借鑒 Pegg 等的這一思想,Jomha 等在對影響玻璃化保存的多個因素進行優化的基礎上,實施了較為成功的人關節軟骨玻璃化保存[5].實踐證明,邊降溫、邊提高低溫保護劑濃度的方法是行之有效的,但要在加載低溫保護劑時加以貫徹,則低溫保護劑在寬溫度范圍內對軟骨樣品的滲透性數據必不可少。然而,目前研究者對低溫保護劑滲透關節軟骨過程的研究大都局限于 0℃以上溫區[15 -23],一方面可能是 0℃以下溫區滲透實驗操作上的困難,另一方面可能是大多數研究者仍習慣嘗試采用傳統的玻璃化法( 見圖 1) 來保存關節軟骨。鑒于此,筆者所在的研究小組設計并搭建了專門的實驗裝置( 見圖 3) ,首次研究了 - 10、- 20 和- 30℃ 時二甲亞砜滲透羊軟骨樣品的過程,并結合Fick 擴散定律擬合得了相應的擴散系數數據[21].有關該實驗裝置的詳細介紹可參見文獻[9,25 -26].

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