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    尿蛋白質的膜上保存技術和丙酮沉淀保存技術對比

    時間:2014-09-12 來源:未知 作者:學術堂 本文字數:4296字
    論文摘要

      生物標志物的最重要特征是變化.血液是人體內環境的一部分,由于受穩態機制的影響不易容納變化,而尿液沒有任何穩定的機制,所以尿液也可能是比血液更好的生物標志物來源[1-2].尿蛋白質是尿液富含信息的重要承擔者[3],然而正因為尿蛋白質承擔著容納人體變化的重要角色,影響尿蛋白質變化的因素也眾多[4-7].

      因此,盡管利用蛋白質組學已成功地找到了一批能夠反映不同疾病變化的具有廣大臨床應用前景的候選標志物 (群),但在真正應用于臨床之前還需對這些候選標志物 (群) 進行大規模的臨床樣本驗證[8-11].而這無疑對大量保存尿蛋白質臨床樣本的技術提出了挑戰.

      尿液由于具有蛋白質濃度稀、體積大、含鹽高和原液中蛋白質易降解的特點,不適合直接大規模的原液保存,需要將尿液蛋白質提取出來保存[12-13].丙酮沉淀是常用的尿液蛋白質提取方法[14-16],但需要耗費大量的有機溶劑,不利于實驗室及臨床的應用,而尿蛋白質的膜上保存是可行的解決方案之一.將尿液直接快速通過硝酸纖維膜,尿液蛋白質被吸附在硝酸纖維膜上,將膜干燥后真空保存.此種方法簡單、快速、經濟及占用保存空間小,蛋白質被吸附在膜上干燥保存阻止了蛋白質的降解,非常適合于臨床大量尿液樣本蛋白質的保存[17].這項研究在蛋白質組學水平上對尿蛋白質的膜上保存技術和丙酮沉淀保存技術進行了比較,并且推薦了不同技術適用的條件.

      1 材料與方法

      1.1 溶液配制

      裂解緩沖液 (10 mL):尿素4.2 g,硫脲1.54 g,Tris 0.05 g,DTT 0.04 g,雙蒸水定容至 10 mL.磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液 (pH 6.0):12.3 mL 1 mol/L Na2HPO4與 87.7 mL 1 mol/LNaH2PO4混勻后,再用5 mol/L NaOH調pH至6.0.

      1.2 尿液采集

      微量蛋白尿液樣本 100 mL,7 200 r/min 離心 45 min 取上清,–80 ℃凍存.

      1.3 丙酮沉淀制備尿蛋白質

      取 15 mL 尿液上清,置于 250 mL 離心瓶中,加入 45 mL 于–20 ℃預冷的丙酮,置于–20 ℃冰箱中沉淀 4 h.4 ℃、12 000 r/min 離心 25 min,棄上清,室溫晾干沉淀后加入適量裂解緩沖液重 溶 蛋 白 質 , 轉 移 至 EP 管 后 于 4 ℃ 下12 000 r/min 離心 15 min,將上清轉移至新 EP管中,測蛋白質濃度后–80 ℃凍存備用.

      1.4 硝酸纖維膜保存尿蛋白質

      1.4.1 制備用于尿蛋白質保存的硝酸纖維膜

      取尿液上清 15 mL,加入 7.5 mL 磷酸鹽緩沖液,混勻;根據真空抽濾瓶的面積剪裁合適的濾紙和孔徑 0.22 μm 硝酸纖維膜 (一般真空抽濾瓶直徑 57 mm,其有效過濾面積直徑為42 mm);依次將 4 層濾紙和一層硝酸纖維膜用水潤濕后置于真空抽濾瓶上 (濾紙在下,硝酸纖維膜在上),連接好真空抽濾裝置;將尿液倒入,開啟真空抽濾裝置,通過調節真空泵,使尿液逐滴滴下;取下硝酸纖維膜置 56 ℃烤箱烘干后,封到真空包裝袋內真空保存.

      1.4.2 硝酸纖維膜上尿蛋白質洗脫

      將硝酸纖維膜裁去未吸附蛋白質的邊,保留有效過濾面積;然后將吸附蛋白質的硝酸纖維膜裁剪置于 2 mL 離心管中,依次加入 1.7 mL丙酮,250 μL 0.5%碳酸氫銨水溶液后,強烈振搖10 min (vortex),然后 4 ℃放置 1 h;12 000 r/min離心 15 min,棄上清,室溫放置 30 min,晾干;加入 300–400 μL 裂解緩沖液,吹打后超聲10 min,重溶蛋白質;吸取重溶后的溶液置于新EP 管中 12 000 r/min 離心 15 min,取上清,測蛋白質濃度,–80 ℃凍存備用.

      1.5 蛋白質酶切與 LC-MS/MS 分析

      取 100 μg 蛋白質,按 Wisniewski 等[18]方法酶切,酶切后肽段用 Oasis 小柱除鹽.除鹽后肽段 上 色 譜 分 離 (Waters UPLC) : 洗 脫 時 間120 min,色譜柱流速 0.5 μL/min,洗脫液由流動相A (0.1%甲酸+2%乙腈+97.9%水) 和流動相B (0.1%甲酸+89.9%乙腈+10%水) 組成,洗脫梯度為 5%–40%流動相 B.反相柱洗脫下的多肽用LTQ-Orbitrap Velos 進行質譜掃描.質譜數據采集 為 數 據 依 賴 模 式 , 全 掃 描 m/z 范 圍 :

      300–2 000,一個全掃描后對豐度最高的 20 個離子分別進行碎裂和二級掃描,分離寬度:3 m/z,動態排除時間:l min.全掃描在 Orbitrap 中進行,母離子分辨率為 60 000,整個掃描過程把m/z 為 445.120 025 的離子定為內標隨時校正質量數偏差;子離子掃描采用離子阱掃描模式,碎裂能量為正常碰撞能量的 35%,q 值 0.25,活化時間:10 ms.

      1.6 質譜數據檢索

      二級質譜結果用 Mascot 2.4[19]進行數據庫檢索,所用數據庫為 Swiss-Prot 蛋白質數據庫[20].檢索條件:胰酶酶切;允許有 2 個漏切位點;固定修飾為半胱氨酸的脲基甲基化;母離子質量精確度 10×106;子離子質量精確度0.5 Da.肽段評分 (Ions score or expect cutoff)設定為 0.05,蛋白質假陽性率 (FDR) <1%[21],且每個蛋白質鑒定 2 個不同的肽段以上.

      2 結果

      2.1 SDS-PAGE 分析

      同一份尿液均勻分成 6 份,每份 15 mL,分別采用硝酸纖維膜法和丙酮沉淀方法處理 3 份.每份取 25 μg 尿蛋白質進行 SDS-PAGE 分析 (圖 1).

      論文摘要

      圖 1 顯示兩種處理尿蛋白質方法,從方法重復性上看,均具有較好的重復性;從保存尿蛋白質條帶來看,均涵蓋了從高到低分子量范圍,主要條帶類似,但不同條帶強度有一些差異.

      2.2 兩種方法質譜鑒定蛋白質重復性比較

      分別采用硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法處理3 份同樣尿液.經質譜鑒定,硝酸纖維膜法制備3 份尿液分別鑒定到 402、424 和 393 個蛋白質,總共鑒定了 495 個蛋白質,共同鑒定 326 個蛋白質,蛋白質鑒定的重復率 (重復率=共同鑒定出的蛋白質數/平均鑒定出的蛋白質數×100%)為 80.2% (圖 2A);丙酮沉淀法制備 3 份尿液分別鑒定到 395、405 和 377 個蛋白質,總共鑒定463 個蛋白質,相同鑒定 324 個蛋白質,蛋白質鑒定的重復率 (重復率=共同鑒定出的蛋白質數/平均鑒定出的蛋白質數×100%)為 82.6% (圖2B).3 份同樣尿液硝酸纖維膜法處理共同鑒定蛋白質 (326 蛋白質) 與丙酮沉淀法處理共同鑒定蛋白質 (324 蛋白質) 相比,相同蛋白質有 237個,兩種方法鑒定蛋白質的重復率 (重復率=共同鑒定出的蛋白質數/平均鑒定出的蛋白質數×100%)為 73%.其中有 89 個蛋白質僅在 NC 膜法中重復鑒定,有 87 個蛋白質僅在丙酮沉淀法中重復鑒定.將兩種方法獨有鑒定蛋白質分別按照蛋白質分子量和等電點分布范圍分類,見圖 3 和圖 4.

    論文摘要

    論文摘要

      圖 3 顯示在蛋白質分子量小于 30 kDa 范圍內,丙酮沉淀法獨有鑒定蛋白質數目比例比 NC 膜法高,在大于 30 kDa 的范圍內,NC 膜法獨有鑒定蛋白質數目比例比丙酮沉淀法高.提示在保存分子量小于 30 kDa 的蛋白質時丙酮沉淀法比 NC膜法更優異,在保存分子量大于 30 kDa 的蛋白質時 NC 膜法比丙酮沉淀法更優異.但是更重要的是在不同分子量范圍內,兩種方法都有對方未鑒定蛋白質,提示在保存不同分子量的蛋白質樣本時,這兩種方法都具有互補性.圖 4 顯示在蛋白質不同等電點分布范圍內,兩種方法獨有鑒定蛋白質數目比例一致,提示兩種方法在蛋白質等電點選擇偏好性上沒有顯著差異.在不同等電點分布范圍內,兩種方法同樣均有對方未鑒定蛋白質,說明在保存不同等電點的蛋白質樣本時,這兩種方法同樣都具有互補性.

      2.3 兩種方法質譜鑒定蛋白質譜圖數的變異系數比較

      三個共同樣本經硝酸纖維膜法處理共同鑒定326 個蛋白質,經丙酮沉淀法處理共同鑒定 324個蛋白質,兩者蛋白質鑒定數目類似.將這些蛋白質按照蛋白質鑒定譜圖數的范圍進行分類(圖 5).

    論文摘要

      在 200–1 000、100–200 和 50–100 高譜圖數區間內,硝酸纖維膜法鑒定蛋白質稍微多一些,但并不顯著,總體看兩種方法鑒定蛋白質數在譜圖數分布上并沒有明顯區別.

      蛋白質變異系數是評價兩種方法重復性的關鍵指標.蛋白質鑒定的譜圖數與蛋白量之間具有正相關性[22].將兩種方法鑒定蛋白質按照蛋白質鑒定譜圖數的 CV 值 (變異系數) 分類(圖 6).兩種方法鑒定蛋白質的 CV 值均主要集中在 0–30%區間之內,圖 6B 顯示 0–30%區間內兩種方法鑒定蛋白質數幾乎相同,均占到了總鑒定蛋白質數的 3/4 以上.雖然 0–30%區間內兩種方法鑒定蛋白質數相同,但是圖 6A 顯示硝酸纖維膜法在 10%–20%和 20%–30%區間內的蛋白質數少于丙酮沉淀法,而在變異系數最小的0–10%區間內多于丙酮沉淀法,而這個區間蛋白質數的區別甚至是圖 6A 六個區間區別中最大的,這說明在低變異系數區間內,硝酸纖維膜法的表現甚至優于丙酮沉淀法.但是總體看兩種方法鑒定蛋白質在 CV 值上并沒有顯著區別,硝酸纖維膜法處理尿蛋白質鑒定重復性與丙酮沉淀法類似.
    論文摘要

      3 討論

      生物標志物研究終將進入大規模臨床樣本驗證階段.所需保存樣本的數量可能成千上萬,甚至幾十萬、上百萬都有可能.而且這種保存一定是跨區域 (中國各地) 和跨時間 (保存一個人從出生到死亡不同時間段) 的保存.尿液樣本中的蛋白質富含人體重要信息,是一個亟待開發的生物標志物"金礦".因此一個簡單、經濟、快速和持久保存尿蛋白質樣本的方法無疑極大地促進了生物標志物的研究[23-25].將尿液快速通過硝酸纖維膜,蛋白質迅速吸附在硝酸纖維膜上,將膜干燥真空保存,這種方法有望實現長久保存幾十萬尿蛋白質樣本的需求.丙酮沉淀是常用的尿液蛋白質提取技術.

      加入丙酮的體積一般是尿液體積的 3 倍,而由于尿液具有體積大、濃度低的特點,丙酮沉淀處理方法需要耗費大量的有機溶劑,不利于丙酮沉淀方法的應用.本研究主要在方法重復性上將硝酸纖維膜法和丙酮沉淀法進行比較.研究發現兩者均具有較高的蛋白質鑒定重復率(硝酸纖維膜法 80.2% vs 丙酮沉淀法 82.6%),兩者并沒有顯著區別.兩者鑒定蛋白質數也沒有顯著區別 (硝酸纖維膜法 326 個蛋白質 vs 丙酮沉淀法 324 個蛋白質).將兩種鑒定蛋白質的方法按照蛋白質譜圖數的分布歸類,兩者也沒有差異,甚至硝酸纖維膜法鑒定高譜圖數蛋白質的數量還要稍多一些.按照譜圖數定量,將兩種鑒定蛋白質的方法按照蛋白質的 CV 值分布分類,發現不同 CV 值范圍內兩種方法鑒定蛋白質的數目類似,甚至硝酸纖維膜法鑒定到更多數量的低 CV 值蛋白質.綜上所述,硝酸纖維膜法處理尿蛋白質的重復性與丙酮沉淀法一樣好.方法的重復性是決定其是否可用的最關鍵因素,因此硝酸纖維膜法可以應用于大規模臨床尿液樣本的保存.只是受限于膜單位面積的載樣量,如果要保存大量的尿蛋白質,則需要更大的膜面積.對于大量蛋白尿的情況,需要前期保存大量的蛋白質以便后期去除高豐度蛋白質后還有足夠的蛋白質量,這種情況也許需要采用丙酮沉淀方法處理尿蛋白質.如果不是這種情況,一般硝酸纖維膜保存的尿蛋白質量足夠進行質譜分析和臨床驗證.

      但是硝酸纖維膜方法與丙酮沉淀法保存的蛋白質不盡相同.本研究發現在保存分子量小于 30 kDa 的蛋白質時丙酮沉淀法比 NC 膜法更優異,在保存分子量大于 30 kDa 的蛋白質時 NC膜法比丙酮沉淀法更優異.但是需要說明的是在不同分子量范圍內,兩種方法都有對方未鑒定蛋白質,在保存不同分子量的蛋白質樣本時,這兩種方法都具有互補性.兩種方法在蛋白質等電點選擇偏好性上沒有顯著差異,在保存不同等電點的蛋白質樣本時,這兩種方法同樣都具有互補性.對于珍貴的蛋白質樣本,建議采用兩種方法共同保存.因此在生物樣本庫建立的初始階段需要考慮不同方法保存尿蛋白質的異同和各自優缺點,選擇合適的保存技術.

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