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    可調控脂肪來源干細胞成骨分化的生物支架材料

    時間:2019-12-17 來源:中國組織工程研究 作者:張圣敏,劉超 本文字數:21845字

      摘    要: 背景:脂肪來源干細胞獲取便捷且具有顯著的成骨分化能力,被認為是骨缺損修復的理想種子細胞。然而骨組織工程學的研究進展揭示,生物支架材料改性能夠直接調控干細胞的成骨分化。目的:綜述能夠調控脂肪來源干細胞成骨分化效果的各種生物支架材料。方法:由第一作者通過檢索中國知網、萬方、維普、Pub Med、Embase和Web of Science數據庫2016年1月至2019年5月發表的相關文獻,檢索詞為“脂肪干細胞,支架材料,成骨,金屬,鈦;Adipose derived stem cells,scaffold,osteogenic,metal,Ti”,最終選取符合標準的文獻62篇。結果與結論:用于骨組織工程的支架材料分為無機材料、天然高分子材料、合成高分子材料3類,無機材料包括羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃、鈦金屬、鎂金屬,天然高分子材料包括膠原、絲素蛋白、殼聚糖,合成高分子材料包括聚己內酯、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物-聚乳酸-羥基乙酸共聚物。設計能與細胞相互作用以指導其生物反應和骨分化的材料研究一直層出不窮,但如何營造更安全、更合理、更貼近生物體內的細胞的生長微環境仍然面臨著很多困難。對生物支架材料的改性能夠直接調控干細胞的成骨分化,同時成骨誘導之外的血管化及植入后的感染也是需要關注的問題。

      關鍵詞: 脂肪來源干細胞; 支架材料; 成骨分化; 骨組織工程; 羥基磷灰石; 磷酸三鈣; 膠原; 3D打印;

      Abstract: BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are easy to access and have strong proliferative capacity, which are considered as ideal seed cells for bone defect repair. The bone tissue engineering research progress reveals that bioscaffold material modification can directly regulate the osteogenic differentiation of stem cells. OBJECTIVE: To review various biological scaffold materials that can regulate the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells. METHODS: The first author searched the articles in CNKI, WanFang, VIP, PubMed, Embase and Web of Science databases published from January 2016 to May 2019. The search terms were “adipose derived stem cells, scaffold, osteogenic, metal, Ti” in Chinese and English, respectively. Finally 62 eligible articles were selected. RESULTS AND CONCLUSION: Scaffold materials for bone tissue engineering are classified into inorganic materials(hydroxyapatite, tricalcium phosphate, bioglass, titanium, and magnesium), natural polymer materials(collagen, silk fibroin, and chitosan) and synthetic polymer materials(polycaprolactone, polylactic acid, polyglycolic acid and poly(lactic-co-glycolic acid)). The studies on materials that interact with cells to guide their biological response and bone differentiation are increasing. But how to create a safe, rational, and close to the micro-environment of cell growth in vivo is a challenge. Modification of bioscaffold materials can directly regulate osteogenic differentiation of stem cells. Moreover, vascularization and post-implantation infections are issues of concern.

      Keyword: adipose-derived stem cells; scaffold materials; osteogenic differentiation; bone tissue engineering; hydroxyapatite; tricalcium phosphate; collagen; three-dimensional printing;

      文章快速閱讀:

      文章特點—

      (1)種子細胞和支架材料的選擇是骨組織工程的核心問題;

      (2)脂肪來源干細胞因其獲取便捷和顯著的成骨分化能力等優勢,被認為是骨缺損修復的理想種子細胞;
     

    可調控脂肪來源干細胞成骨分化的生物支架材料
     

      (3)文章詳細綜述了能夠調控脂肪來源干細胞成骨分化效果的各種生物支架材料,旨在為新型生物支架材料的研發和臨床轉化提供理論支持。

      文題釋義:

      脂肪干細胞的優勢:脂肪來源干細胞具有以下特點:高增殖能力和分泌活性;兼具多向分化潛能;通過其免疫調節能力,能夠提高移植后的愈合效果;來源豐富,可在自體或異體上迅速提取,以上優勢使其成為骨組織工程的理想種子細胞。

      骨組織工程支架材料的分類:主要分為3類,無機材料、天然高分子材料、合成高分子材料,無機材料包括羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃、鈦金屬、鎂金屬,天然高分子材料包括膠原、絲素蛋白、殼聚糖,合成高分子材料包括聚己內酯、聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物-聚乳酸-羥基乙酸共聚物。

      0.  引言Introduction

      由于腫瘤、損傷、炎癥、先天性畸形等導致的骨組織缺損,嚴重影響了患者生活質量,臨床常用的修復技術主要是自體和同種異體骨移植,但均存在移植骨形態匹配度差、感染及免疫排斥等問題。骨組織工程技術的飛速發展為解決這一問題提供了新的方向。種子細胞和支架材料的選擇是骨組織工程的核心問題。脂肪來源干細胞具有高增殖能力和分泌活性;兼具多向分化潛能;通過其免疫調節能力,能夠提高移植后的愈合效果;來源豐富,可在自體或異體上迅速提取[1],因此是骨組織工程的理想種子細胞。

      理想的骨修復支架材料應該具備以下特性:良好的生物相容性及生物安全性;與骨形成速度相匹配的生物降解率;具有足夠的孔隙,以保證細胞長入和營養物質運輸,并在支架內部進行血管化過程;能實現形態重塑,以保證臨床不同病例所需的外部形態;良好的成骨誘導性;良好的機械性能和理化特性。為了創設性能優越的支架材料,研究者進行了眾多的相關研究。用于骨組織工程的支架材料分為3類:無機材料、天然高分子材料、合成高分子材料,見表1。文章重點就不同支架材料對脂肪來源干細胞誘導成骨的研究進行綜述。

      表1 支架材料的分類和特點
    表1 支架材料的分類和特點

      1、 資料和方法Data and methods

      1.1、 資料來源

      以“脂肪干細胞,支架材料,成骨,金屬,鈦;Adipose derived stem cells,scaffold,osteogenic,metal,Ti”為關鍵詞,在中國知網、萬方、維普、Pub Med、Embase和Web of Science數據庫搜索2016年1月至2019年5月發表的相關文獻。

      1.2、納入與排除標準

      納入標準:關于支架材料改性促進脂肪干細胞成骨分化的研究;關于脂肪干細胞聯合支架材料修復骨缺損的研究。

      排除標準:研究中支架材料只承擔支架作用而無成骨誘導作用的研究;重復性研究。

      1.3、 數據提取

      共檢索到文獻319篇,其中中文文獻127篇、英文文獻192篇,排除與研究目的相關性差及內容陳舊、重復的文獻257篇,納入62篇符合標準的文獻進行綜述,見圖1。

      圖1 文獻檢索流程
    圖1 文獻檢索流程

      1.4 、質量評價

      符合納入標準的62篇文獻中,文獻[1]探討了脂肪干細胞在骨組織工程的優勢;文獻[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]探討了改性無機材料對脂肪干細胞成骨分化的研究進展;文獻[32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50]探討了改性天然高分子材料對脂肪干細胞成骨分化的研究進展;文獻[51,52,53,54,55,56,57,58,59,60]探討了改性合成高分子材料對脂肪干細胞成骨分化的研究進展;文獻[61,62]探討了材料空間結構的研究進展。

      2、 結果Results

      2.1、 無機材料

      無機材料具有良好的生物相容性,機械強度較高,但柔韌性和親水性較差、材料較脆,并且在機體里降解速度緩慢。因此,無機材料只能充當填充材料,而不能獨立作為骨組織工程支架材料用于負重成骨的研究。

      2.1.1、 羥基磷灰石

      羥基磷灰石是最常見的生物活性材料,其化學式為Ca10(PO4)6(OH)2,是骨缺損修復及相關替代材料的主要研究方向。羥基磷灰石的主要優點是具有較好的生物相容性、骨傳導性、可降解性,缺點為脆性大、拉伸性較差。

      羥基磷灰石可以通過其骨傳導性能和良好生物相容性特性誘導骨再生。納米結構羥基磷灰石具有更大潛力,因為其能夠釋放Ca2+和PO43-以誘導干細胞成骨分化[2]。然而由于脆性特征,該材料的應用受到限制。聚合物材料可以通過增加韌性和彈性對羥基磷灰石進行改性。WANG等[3]研發了多孔納米羥基磷灰石和馬來酸酐接枝的聚(甘油癸二酸酯)復合支架,支架平均孔徑150-300μm,接種人脂肪來源干細胞后的RUNX2、骨鈣素、骨膠原1A1等成骨相關因子表達顯著增高,證明該材料能誘導脂肪來源干細胞成骨分化。SATTARY等[4]構建聚已內酯/膠原/納米羥基磷灰石/維生素D3支架,堿性磷酸酶活性及茜素紅染色及成骨基因骨膠原1、堿性磷酸酶、RUNX2高表達,證實該支架可增強脂肪來源干細胞成骨分化的能力。AMJADIAN等[5]將脂肪來源干細胞接種到左旋聚乳酸/納米羥基磷灰石/地塞米松/明膠復合支架上,可以刺激堿性磷酸酶活性及成骨基因堿性磷酸酶、骨形態發生蛋白2、RUNX2成骨基因的表達,從而促進脂肪來源干細胞成骨分化。由于納米結構羥基磷灰石具有良好的細胞相容性,會使大多數細胞黏附在其表面,最終導致軟硬組織粘連。為避免此情況,MA等[6]構建了羥基磷灰石納米帶/聚乳酸Janus膜,在沒有生長因子的條件下可以促進堿性磷酸酶活性,增加RUNX2、骨橋素、骨鈣素成骨基因表達,從而促使脂肪來源干細胞的成骨分化,體內實驗顯示聚乳酸可發揮屏障作用,避免骨與鄰近軟組織的術后粘連。

      對羥基磷灰石支架用化學元素進行表面修飾,可促進脂肪來源干細胞成骨分化。GAO等[7]制備了鍶-羥基磷灰石-接枝-聚(γ-芐基-L-谷氨酸)納米復合材料,通過雙重噴射法制備具有高度相互連接的大孔的微載體,體外實驗顯示堿性磷酸酶、RUNX2、骨膠原1、骨鈣素呈現高表達,體內實驗8周micro-CT顯示小鼠骨缺損模型中新形成骨體積和骨密度均顯著提高。BOSTANCIOGLU等[8]將人脂肪來源干細胞接種在金屬離子(Zn、Ag和Cu)摻雜的羥基磷灰石納米涂層表面,脂肪來源干細胞能夠保持較高的細胞數量和細胞活力,羥基磷灰石-Zn Ag支架最為顯著,在無外源性成骨刺激下,脂肪來源干細胞能夠在羥基磷灰石-Com(對照)、羥基磷灰石-Ag、羥基磷灰石-ZnAg和羥基磷灰石-ZnAgCu表面分化為成骨細胞,其中羥基磷灰石-Ag支架成骨能力最強。

      2.1.2、 磷酸三鈣

      磷酸三鈣的化學式為Ca3(PO4)2,按結構分為高溫相(α-磷酸三鈣)和低溫相(β-磷酸三鈣)。β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性、骨引導作用和可降解性能,在骨缺損修復中應用廣泛。β-磷酸三鈣可通過釋放鈣磷促進組織礦化,顯著增強新骨形成和鈣化,是骨組織工程的潛力材料。

      羥基磷灰石/β-磷酸三鈣構成的復合材料應用廣泛,其具有良好的生物相容性、可降解性、骨傳導性、合適的孔隙率及骨誘導能力。CANCIANI等[9]以30%羥基磷灰石和70%β-磷酸三鈣制備雙向磷酸鈣支架,結果顯示堿性磷酸酶活性升高和鈣沉積物增加,證明提高了脂肪來源干細胞的成骨分化程度。β-磷酸三鈣/膠原支架材料是一種較為常見的復合材料,其從仿生學角度模擬了骨組織成分。LI等[10]制備了羥基磷灰石/β-磷酸三鈣復合支架,熒光顯微鏡顯示復合支架上的細胞于24 h開始顯示具有典型成骨細胞樣形態,成骨相關基因堿性磷酸酶、骨形態發生蛋白2、骨鈣素、骨橋素、骨膠原1A1等表達上調,證實含有β-磷酸三鈣的支架能更好地促進脂肪來源干細胞的成骨分化。

      傳統支架在制作過程中很難完全符合骨缺損形狀,獲得均勻一致的孔徑及孔隙率,因此很多學者開始嘗試用3D打印技術制作支架。PARK等[11]制作3D打印的聚已內酯/β-磷酸三鈣支架,堿性磷酸酶活性、von Kossa染色及骨膠原1、骨鈣素、RUNX2等成骨基因表達結果顯示,3D打印的聚已內酯/β-磷酸三鈣支架顯著提升了人脂肪來源干細胞的成骨能力。LEE等[12]使用3D打印技術制作聚已內酯/磷酸三鈣支架,體外實驗顯示成骨相關基因骨膠原1、骨鈣素、RUNX2表達增高,體內實驗通過CT及組織學檢查顯示小獵犬上頜骨缺損有較好成骨效果,證實3D打印聚已內酯/磷酸三鈣可促進脂肪來源干細胞的成骨分化。KURZYK等[13]將人脂肪來源干細胞接種到覆蓋有磷酸三鈣的聚已內酯(聚已內酯+5%磷酸三鈣)3D打印支架上,茜素紅染色、堿性磷酸酶活性測定結果顯示聚已內酯/磷酸三鈣支架對脂肪來源干細胞成骨分化有促進作用。

      支架內初始血管的形成及其與宿主脈管系統的關系,可更好地確保骨組織修復。缺氧誘導因子1α信號傳導被認為是血管形成的關鍵因子,促進干細胞成骨活性。二甲基乙二酰基甘氨酸可在正常氧條件上調缺氧誘導因子1α蛋白的表達水平,選擇二甲基乙二酰基甘氨酸輸送的新型載體可以提升脂肪來源干細胞成骨水平。JAHANGIR等[14]制備遞送二甲基乙二酰基甘氨酸的β-磷酸三鈣-藻酸鹽-明膠支架并培養脂肪來源干細胞,體外實驗證實堿性磷酸酶活性增高,鈣沉積增多,成骨相關基因堿性磷酸酶、骨鈣素上調,證實促進了脂肪來源干細胞的成骨分化,體內實驗蘇木精-伊紅染色、馬松染色及CT結果顯示鼠顱骨臨界骨缺損獲得了更好的成骨效果。

      2.1.3 、生物活性玻璃

      生物活性玻璃是一種擁有良好生物相容性、可降解性能的骨組織修復材料,通過釋放不同離子如硅(Si)、鈣(Ca)上調成骨相關基因,促進干細胞的成骨分化。

      雖然生物活性玻璃具有良好的生物相容性和生物活性,但是脆性大,而高分子材料具有良好的抗彎及抗拉強度,將兩者復合后可綜合2種不同體系的優點。MAHDAVI等[15]采用靜電紡絲技術成功制備了聚-L-乳酸支架,在此支架涂覆納米生物活性玻璃,將馬脂肪來源干細胞在納米生物活性玻璃包被的聚-L-乳酸納米纖維支架上培養,結果顯示納米生物活性玻璃-聚-L-乳酸支架可促進成骨相關基因RUNX2、骨膠原1、堿性磷酸酶的表達,增強堿性磷酸酶活性,從而促進脂肪來源干細胞的成骨分化。DU等[16]通過改性溶膠-凝膠和顆粒增強技術構建介孔生物活性玻璃支架,其有高度互聯的大孔隙(200-500μm),可為血管及骨骼生長提供營養物質并為廢物運輸提供條件;通過接種內皮誘導的脂肪來源干細胞對支架進行預血管化,以修復大鼠股骨臨界尺寸的骨缺損,證實攜帶內皮誘導的脂肪來源干細胞預血管化介孔生物活性玻璃支架可以產生快速血管生成和骨再生。JING等[17]將脂肪來源干細胞接種到淫羊藿苷摻雜的45S5生物活性玻璃,體外實驗顯示血管內皮生長因子蛋白分泌水平升高,體內植入12周通過Micro-CT、組織學和免疫組織化學染色顯示可顯著促進大鼠顱骨骨缺損修復,證明淫羊藿苷/45S5生物玻璃接種脂肪來源干細胞可明顯促進成骨和血管生成。

      2.1.4、 鈦金屬

      目前臨床最為常用的金屬植入材料為鈦及其合金。鈦材料機械強度高,耐腐蝕,抗疲勞性好,價格經濟,主要用于承力骨、關節和牙等硬組織的修復和替換,夾板、縫合針、骨螺釘等植入器件,心血管和軟組織修復中的支架材料。

      鈦支架材料不同的孔徑和孔隙率能夠影響脂肪來源干細胞的成骨分化。LONGWEI等[18]采用陽極氧化工藝制備二氧化鈦納米管,研究發現直徑為70 nm的納米管可以通過抑制RBP2表達上調成骨相關基因區域H3K4的甲基化水平,從而促進成骨效果。MALEC等[19]采用陽極氧化工藝制備納米多孔陽極二氧化鈦膜,形成高度有序的納米表面結構,其中108 nm孔徑材料不僅提高了脂肪來源干細胞的增殖能力,堿性磷酸酶、骨形態發生蛋白2、RUNX2等成骨相關因子表達也相應增加。

      隨著細胞外基質環境在納米尺度的揭示,針對植入材料表面的研究開始走向基于仿生的微納米多級結構建立及生物性能分析。微米結構可增加骨-植入體之間的機械嵌合力,促進細胞的增殖與黏附;納米結構可以通過調控細胞內信號分子通路進而影響細胞行為。微納米多級結構對細胞黏附、增殖和分化的顯著促進作用,已被很多研究者所證實。MOON等[20]利用靶離子誘導等離子體濺射在微米Ti-6Al-4V表面制備分層微納米結構,并驗證了其對前成骨細胞MC3T3-E1的黏附和增殖有顯著促進作用,犬下頜骨體內實驗顯示骨與種植體的接觸面積和新骨體積顯著改善。JIANG等[21]采用噴砂/酸蝕和陽極氧化在鈦表面制作分層微納米結構,其表面培養MC3T3-E1細胞的堿性磷酸酶活性升高,細胞礦化顯著增高,RUNX2、骨膠原1、骨鈣素成骨基因表達顯著上調,證實微納結構鈦對MC3T3-E1細胞的成骨有促進作用。微納米多級結構對干細胞的成骨誘導性也得到了相關驗證。LI等[22]利用微弧氧化在鈦表面制備了一種新型的“皮質樣”微/納米雙尺度結構二氧化鈦涂層,體外實驗證實“皮質樣”結構對骨髓間充質干細胞的黏附、擴散和分化有顯著促進作用,體內實驗“皮質樣”結構表現出更突出的細胞相容性和骨整合。ZHOU等[23]制作了摻雜有鍶、鈷和氟的微孔二氧化鈦/磷酸鈣涂層鈦,其具有分級的微/納米結構。二氧化鈦/磷酸鈣涂層鈦可抑制革蘭陽性及陰性細菌的定植和生長,刺激大鼠骨髓干細胞中關鍵血管生成因子血管內皮生長因子、缺氧誘導因子1a的表達,以及成骨相關基因堿性磷酸酶、骨橋素、骨膠原1、骨鈣素的表達。體內動物實驗顯示,二氧化鈦/磷酸鈣涂層鈦可誘導更多新骨和更緊密的骨結合。這些都提示微納米多級結構鈦有望成為誘導脂肪干細胞成骨分化的新型材料。

      對鈦材料進行表面化學修飾,可通過改變脂肪來源干細胞成骨微環境進而促進其成骨分化。KIM等[24]將Sr修飾于鈦材料表面,證明Sr的釋放可以主動誘導脂肪來源干細胞在納米鈦材料表面的黏附相關因子vincu-lin、talin、RHOA呈高表達,同時堿性磷酸酶、骨唾液酸蛋白、骨鈣素、骨保護素、RANKL等成骨相關因子的表達也相應增加。MARYCZ等[25]使用溶膠-凝膠法將2種不同劑量的生物活性鞘脂S1P融入二氧化鈦涂層,降低其表面粗糙度,二氧化鈦/S1P(80?g/L)上脂肪來源干細胞生成骨結節數量最多,骨橋素、骨形態發生蛋白2表達也顯著增加,S1P可以通過激活S1PR1/JAK/STAT信號通路參與該過程。HEO等[26]將金納米顆粒(GNP)均勻地固定在二氧化鈦表面制成二氧化鈦-金納米顆粒,以此材料為培養基底誘導人脂肪來源干細胞成骨分化,其成骨標志物骨膠原1、RUN2、骨鈣素、骨唾液酸蛋白均表達上調,堿性磷酸酶活性和鈣沉積測定呈現高水平。

      金屬表面進行適當處理后能夠形成具有緩釋促成骨藥物的結構。YUNSONG等[27]在鈦材料表面構建具有緩釋作用的磷酸鈣涂層,分別負載甲硝唑和辛伐他汀后培養脂肪來源干細胞,證明辛伐他汀緩釋支架上脂肪來源干細胞的RUNX2、骨鈣素等成骨相關因子表達增高并向成骨分化。

      2.1.5 、鎂金屬

      鎂(Mg)及其合金具有良好的生物學、力學相容性和可降解性,其密度和彈性模量與人體骨極為相似,可有效減少應力屏蔽效應,是一種極有前景的骨組織工程支架材料,缺點為機械性能差和在生理環境中易被氧化腐蝕。

      鎂支架材料對脂肪來源干細胞作用的研究目前尚處于鎂對脂肪來源干細胞毒性、活力、增殖及耐腐蝕方面的探索。FAZEL ANVARI-YAZDI等[28]評估Mg-2Zn和Mg-2Zn-xCa(x=1%,2%,3%)合金對脂肪來源干細胞的影響,MTT測定檢查顯示所有合金在24 h對細胞活力并無顯著不利影響,動電位極化分析證實合金元素Zn和Ca的加入提高了鎂的耐腐蝕性。HOU等[29]應用超聲波納米晶體表面改性對AZ31B-鎂材料進行表面處理后,合金硬度、屈服應力和耐磨性均得到顯著改善,但其耐腐蝕性沒有變化,處理前后脂肪來源干細胞與AZ31B-Mg的生物相容性良好,該材料有著潛在誘導脂肪來源干細胞成骨分化的潛能。

      羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、生物活性玻璃均有良好的生物相容性、骨誘導作用,對成骨分化起到積極作用,普遍存在的弱點為材料較脆,需對其進行增韌處理。目前的主要研究趨勢為通過將羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、生物活性玻璃與聚合物等軟質材料混合,在孔隙率、機械強度、生物活性等方面進行綜合調控,以彌補研究不足[30]。此類改性措施對提高材料機械性能起到了積極作用,但對滿足臨床承重部位的植入要求依然存在距離。同時羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、生物活性玻璃的成骨性能已得到廣泛肯定,但對成骨之外的血管化問題研究相對較少,仍然存在一定的空白。

      鈦材料具有良好的生物相容性,是骨科和牙科領域的首選植入物,臨床存在的主要問題為鈦的生物惰性所致與周圍骨組織結合差且彈性模量較高,容易出現周圍骨質吸收及材料松動,通過改性提高鈦材料-骨結合有重要意義。目前較為有前景的研究趨勢為陽極氧化制備二氧化鈦納米管,其具有優越的生物相容性和力學性能,不同納米尺度對成骨調控方面的研究依然有必要進一步開展,且仍需在不同條件下使用不同動物模型加強二氧化鈦納米管的體內研究[31]。鎂金屬由于與骨組織更接近的彈性模量及潛在成骨性能,是一種有前途的骨組織工程材料,在如何提高骨再生和提升耐腐蝕性方面,鎂合金依然有很大的研發空間。

      2.2、 天然高分子材料

      天然高分子材料的生物相容性好,包括膠原、明膠、絲素蛋白、殼聚糖、瓊脂糖、透明質酸、纖維素、纖維蛋白原、硫酸軟骨素、藻酸鹽、氨基葡萄糖、脂質體和細胞外基質等,有利于促進細胞的各項生理功能。

      2.2.1、 膠原

      膠原是構成骨組織的重要成分,具有良好的生物相容性,抗原性小,有利于干細胞的黏附、分化、增殖,由其制備的人工皮膚已應用于臨床。

      單一膠原支架具有降解速率高、機械性能差的缺點,可以結合羥基磷灰石等陶瓷材料制成礦化膠原支架(骨膠原/羥基磷灰石),以改善其機械性能、生物相容性、骨傳導性、骨誘導性和生物降解性。骨膠原/羥基磷灰石可進一步與其他材料復合并進行表面改性,從而促進干細胞的成骨分化。DEWEY等[32]將聚乳酸與微米級孔隙度的骨膠原/羥基磷灰石整合制作了多尺度骨膠原/羥基磷灰石/聚乳酸復合材料,此材料具有優良的機械性能并便于塑型,在缺乏成骨誘導的情況下依然可以促使脂肪來源干細胞向成骨細胞分化。TIFFANY等[33]將硫酸鋅包裹在膠原-黏多糖上形成鋅功能化支架,脂肪來源干細胞在該材料上培養后成骨相關基因骨膠原A2、骨形態發生蛋白2、RUNX2等表達上調,micro-CT顯示礦物質形成顯著增多。CALABRESE等[34]將鎂載入骨膠原/羥基磷灰石培養脂肪來源干細胞,茜素紅染色顯示鈣沉積物增加,RUNX2、骨膠原1A1、堿性磷酸酶成骨相關因子表達上調,顯示其促進脂肪來源干細胞成骨分化的能力。

      膠原也可通過與不同高分子材料復合來增加其機械性能和改善成骨分化能力。TOOSI等[35]用膠原結合聚乙醇酸制備骨膠原/聚乙醇酸支架,脂肪來源干細胞接種到支架上并修復兔顱骨缺損,骨膠原聚乙醇酸/脂肪來源干細胞與骨膠原/聚乙醇酸組堿性磷酸酶等成骨相關基因表達均顯著性上調,CT示兩組均能顯著修復顱骨缺損,且兩者并無顯著差異,這也許與移植細胞數量較少或觀察時間短有一定相關性。MAISANI等[36]構建由Ⅰ型骨膠原和糖基-核苷-氟化組成的糖基-核苷-氟化-骨膠原復合水凝膠,物理水凝膠的加入防止了膠原的收縮和脂肪來源干細胞從凝膠中擴散出來,其機械性能、彈性模量和生物學特性均得以改善,堿性磷酸酶活性升高,茜素紅染色和茜素紅染色顯示鈣沉積物顯著增加,證實糖基-核苷-氟化-骨膠原復合水凝膠促進人脂肪來源干細胞成骨分化的作用。NEDJARi等[37]基于聚(L-丙交酯ε-己內酯)和纖維蛋白原組成的電紡混合納米纖維,制作出了一種3D蜂窩結構支架培養人脂肪來源干細胞,結果顯示堿性磷酸酶活性升高,鈣沉積增加,成骨基因堿性磷酸酶、RUNX2表達上調,證明該支架對人脂肪來源干細胞成骨分化有顯著促進作用。CHEN等[38]制備出負載Sr的氧化石墨烯Sr-GO-Col納米復合材料,此支架將可長期釋放Sr離子,具有更高的保水性和機械性能,能夠通過分泌血管內皮生長因子、骨形態發生蛋白2等血管生成因子經MAPK信號傳導途徑來刺激內皮細胞形成,進而促進脂肪來源干細胞的體外成骨分化,體內研究中將Sr-GO-Col復合材料移植到大鼠顱骨缺損中,12周時也能夠表現出更好的骨再生和血管生成效果。

      對膠原支架進行表面化學修飾可以改變其理化性質,為脂肪來源干細胞成骨分化提供特定的微環境,從而促進脂肪來源干細胞的成骨分化。SASAYAMA等[39]將表沒食子兒茶素沒食子酸酯修飾于明膠海綿支架,其親水性增強,促進了脂肪來源干細胞的黏附能力,可有效誘導脂肪來源干細胞的成骨分化。GURUMURTHY等[40]將彈性蛋白樣多肽修飾于膠原復合材料,18 g/L彈性蛋白樣多肽和6 g/L骨膠原配比的彈性蛋白樣多肽-骨膠原復合物具有更大的拉伸強度和彈性模量,培養的人脂肪來源干細胞上堿性磷酸酶活性增加,茜素紅染色顯示鈣沉積物增加,骨鈣素蛋白定量增高,顯示彈性蛋白樣多肽-骨膠原復合物具有更高的促進脂肪來源干細胞成骨分化能力。

      2.2.2、 絲素蛋白

      絲素蛋白主要來自蠶絲,容易獲得且價格低廉,作為一種天然生物材料具有良好的生物相容性、緩慢的生物降解速率和低炎癥反應等特征,在骨組織工程中應用廣泛。由于單一絲素蛋白制備的支架力學性能降低、韌性減小,很難承受應力,骨細胞附著能力不佳,骨誘導能力有限,很難同時滿足實際應用中對各種不同性質的要求。因此,絲素蛋白通常與其他材料相結合來制備絲素蛋白復合材料支架,通過組分和制備工藝來調節其各方面的性質,以滿足骨組織工程的不同需求。

      絲素蛋白支架最常用到的形態是絲素蛋白靜電紡絲纖維,該支架及其改良產物被證實可增強骨缺損模型中干細胞的成骨分化和骨形成。KO等[41]應用靜電紡絲技術制備制成絲素蛋白/羥基磷灰石支架,然后用聚多巴胺修飾絲素蛋白/羥基磷灰石支架的表面,以形成黏合劑層,最后羥基磷灰石沉積產生絲素蛋白/羥基磷灰石支架的第二層羥基磷灰石,負載人脂肪來源干細胞后植入小鼠顱骨臨界骨缺損模型觀察骨形成情況,證明羥基磷灰石/聚多巴胺/絲素蛋白/羥基磷灰石促進了人脂肪來源干細胞的成骨分化。WANG等[42]利用靜電紡絲技術制備不同質量比的絲素蛋白/聚(丙交酯-共-ε-己內酯)納米纖維支架,該支架可以通過增強骨唾液酸蛋白、骨鈣素、骨膠原1A1、骨橋素成骨基因表達而促進細胞外基質礦化,證明其誘導人脂肪來源干細胞成骨分化的能力。RIBEIRO等[43]將2片由聚對苯二甲酸乙二醇酯單絲間隔開的致密絲素蛋白片組成絲素蛋白-聚對苯二甲酸乙二醇酯支架,該支架呈高度多孔狀,培養的脂肪來源干細胞堿性磷酸酶表達增加,骨鈣素、骨橋素、骨膠原L1成骨基因表達上調,顯示絲素蛋白-聚對苯二甲酸乙二醇酯支架有促進脂肪來源干細胞成骨分化的能力。PINA等[44]采用鹽浸法和冷凍干燥技術制備了結合了Sr、Zn、Mn等離子的絲素蛋白/磷酸三鈣支架,具有可調的孔徑、孔隙率、高互連性和更佳的機械強度,其中絲素蛋白/Zn-Sr-磷酸三鈣支架有最大的孔徑和孔隙率;支架中負載離子不同對脂肪來源干細胞增殖和分化的影響不同,Zn支架更好的促進了脂肪來源干細胞增殖,Sr和Mn支架誘導脂肪來源干細胞的成骨潛能更高,Sr和Zn組合支架對脂肪來源干細胞的增殖和成骨均產生積極影響。

      絲素蛋白支架經改性后能夠具備負載及稀釋藥物的能力,合適劑量的瑞舒伐他汀對骨生成具有潛在的促進作用。KALANI等[45]通過氬射頻將瑞舒伐他汀固定在絲素蛋白納米纖維上,成骨基因堿性磷酸酶、RUNX2水平上調,茜素紅染色顯示鈣沉積物增加,證實瑞舒伐他汀可促進脂肪來源干細胞的增殖和成骨分化。之后KALANI等[46]改進了瑞舒伐他汀釋放支架,將聚乙烯醇和絲素蛋白分別用作殼和核,瑞舒伐他汀分子在納米纖維中以非晶態分散,通過調節殼體流速控制瑞舒伐他汀釋放量,核-殼結構的體外釋放曲線表現出雙相釋放曲線;在負載瑞舒伐他汀納米纖維上培養的人脂肪來源干細胞鈣沉積物增加,堿性磷酸酶、RUNX2、骨鈣素、骨膠原1基因表達上調,顯示改善了細胞增殖并輔助成骨分化。

      2.2.3、 殼聚糖

      殼聚糖化學名為(1,4)聚-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖,可通過化學法和酶解法獲得,是甲殼素脫乙酰基的產物,而甲殼素是甲殼類動物外骨骼的主要組成部分,具有良好的生物相容性、生物降解性、非抗原性、無毒性、抗菌性、止血活性,但其機械強度較差。

      殼聚糖本身即有著良好的骨誘導性,由于其質地硬并且較脆,抗剪切力能力相對較弱,難以獨立用作骨組織工程支架,因此多將殼聚糖與其他材料結合對其性能進行優化。ARDESHIRYLAJIMI等[47]將具有3種不同百分比(10%,15%,20%)的明膠加入到殼聚糖產生3種不同孔隙的多孔殼聚糖支架,孔徑分別為(80±20),(130±20)和(180±20)?m,茜素紅染色、堿性磷酸酶活性、鈣含量測定及RUNX2、骨鈣素、ON、骨膠原1基因表達結果顯示,10%組對脂肪來源干細胞成骨分化促進效果最為明顯。LIAO等[48]將透明質酸-殼聚糖-聚(N-異丙基丙烯酰胺)作為三維有機凝膠基質,嵌入雙相磷酸鈣陶瓷微粒作為礦化骨基質,并進一步用富血小板血漿強化,合成透明質酸-殼聚糖-聚(N-異丙基丙烯酰胺)/富血小板血漿/雙相磷酸鈣熱凝膠水凝膠支架,與兔脂肪來源干細胞共培養并植入兔顱骨缺損模型中,證實富血小板血漿/雙相磷酸鈣可促進透明質酸-殼聚糖-聚(N-異丙基丙烯酰胺)凝膠基質中脂肪來源干細胞的成骨分化,此構建可有效促進缺損部位新骨形成。

      在殼聚糖支架中加入促進成骨的元素,可誘導脂肪來源干細胞成骨。AKDERE等[49]將殼聚糖支架結合羥基磷灰石或結合包含硼(B)的羥基磷灰石(B-羥基磷灰石)構建殼聚糖復合體,培養并驗證人脂肪來源干細胞在支架上的增殖和成骨分化能力,結果表明骨膠原1、RUNX2、骨橋素成骨基因表達上調,證實B-羥基磷灰石/殼聚糖支架具有骨誘導和骨傳導性質,可促進人脂肪來源干細胞的黏附、增殖和成骨分化。

      殼聚糖支架同時也能夠作為靶向載藥、藥物緩釋的載體。WU等[50]將載有AL的殼聚糖/羥基磷灰石微球納入聚(L-乳酸)/納米羥基磷灰石基質中制備新型微球-支架混合體系,顯示新型微球-支架混合體系有長期釋放AL的能力,體外堿性磷酸酶活性和茜素紅染色顯示新型微球-支架混合體系(10%)脂肪來源干細胞的成骨分化顯著增強,體內實驗通過X射線、蘇木精-伊紅以及Masson染色評估進一步顯示新型微球-支架混合體系(10%)支架的成骨能力,新型微球-支架混合體系(10%)支架在8周內完全修復大尺寸(1.5 cm)骨缺損。

      天然高分子材料普遍存在的問題是較差的機械強度,不能獨立用作支架材料,往往需制備成復合材料。膠原支架是其中較早應用于骨組織工程的支架材料,改性的膠原支架在臨床已有廣泛應用,如膠原塞、礦化膠原骨粉。如何更好的提高膠原支架生物活性,使骨組織再生水平進一步優化,提高臨床應用價值也是需要進一步研究的問題。由于絲素蛋白較低的機械性能和有限的骨誘導能力,在骨組織工程的研究仍有很大的空間。雖然已有不少研究起到改善絲素蛋白性能的作用,但改性絲素蛋白依然不能滿足骨組織工程所需要的機械強度兼具成骨性能,而絲素蛋白改性的相關機制研究也相對缺乏,仍需要大量研究彌補空白。

      2.3、 合成高分子材料

      聚己內酯、聚乳酸、聚乙醇酸其共聚物-聚乳酸-羥基乙酸共聚物是目前應用較為廣泛的骨組織工程支架材料。這類材料形成的支架可塑性強,可根據缺損設計外形,更有利于細胞的黏附與分化。但此類材料其親水性較差,影響細胞的吸附;可導致機體發生無菌性炎癥;其機械強度不能達到理想狀態等,依然需要采用不同的方式對其性能進行優化。

      2.3.1、 聚乳酸

      聚乳酸有3種異構體:外消旋聚乳酸、左旋聚乳酸、右旋聚乳酸,是一種常見的生物可降解材料,但降解速率過快,并且聚乳酸的降解產物呈酸性,會引起周圍組織的無菌性炎癥反應,鑒于這一材料的局限性,常常選用復合生物材料滿足骨組織工程需要。ZHANG等[51]設計100,200,300 nm的3種不同直徑的聚乳酸納米柱陣列,見圖2,在無生長因子誘導下培養脂肪來源干細胞的堿性磷酸酶活性升高,成骨相關基因RUNX2、骨橋素、骨鈣素表達上調,茜素紅染色顯示鈣沉積增多。證實聚乳酸納米柱陣列可誘導脂肪來源干細胞的成骨分化,其中200 nm納米柱陣列誘導成骨效果最顯著。TAVANGAR等[52]制備了一種陶瓷涂層納米纖維支架,將左旋聚乳酸納米纖維通過等離子體處理后吸附陶瓷,將具有優于羥基磷灰石骨誘導潛力的硬石包覆在等離子體處理的左旋聚乳酸納米纖維上,其表面接種脂肪來源干細胞的堿性磷酸酶活性升高,鈣沉積物增加,相關成骨基因堿性磷酸酶、骨鈣素表達上調,證實支架提高了脂肪來源干細胞成骨分化程度。BAGESHLOOYAFSHAR等[53]將Zn硅酸鹽礦物納米顆粒涂覆于左旋聚乳酸支架,將馬脂肪來源干細胞與其共培養,顯示Zn硅酸鹽礦物涂層左旋聚乳酸支架對脂肪來源干細胞增殖無毒,且促進脂肪來源干細胞的增殖和成骨分化。KARIMI等[54]將硅鋯鈣石納米顆粒包覆于左旋聚乳酸支架,以脂肪來源干細胞評估其成骨性能,堿性磷酸酶活性升高、鈣礦物沉積增多、骨相關基因RUNX2、堿性磷酸酶、骨鈣素表達上調,證實了其成骨潛能。

      圖2 聚乳酸納米柱陣列[51]
    圖2 聚乳酸納米柱陣列[51]

      聚乳酸-羥基乙酸共聚物是聚乳酸的共聚物,是一種合成的、生物相容的、可生物降解的支架材料,已被用于臨床填補骨缺損。MA等[55]將赤鐵礦納米顆粒依靠逐層組裝技術結合到聚乳酸-羥基乙酸共聚物/聚己內酯復合材料表面,堿性磷酸酶活性增高,成骨相關基因RUNX2、骨膠原1、骨鈣素、堿性磷酸酶表達上調,證實其成骨活性。HAJIHASANI BIOUKI等[56]將辛伐他汀接枝到聚乳酸-羥基乙酸共聚物,此支架呈現高孔隙率(91%)且辛伐他汀釋放時間可超過80 d,堿性磷酸酶活性升高,茜素紅染色結果顯示礦化結節增多,證實辛伐他汀接枝聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架可促進脂肪來源干細胞的成骨分化。

      2.3.2、 聚己內酯

      聚己內酯具有細胞相容性、組織相容性、可降解性和彈性功能,是可吸收材料研究的重點,缺點為柔性和彈性過強,主要通過表面改性或與其他有機高分子材料聚合來拓展其在骨組織工程的使用范圍。

      WANG等[57]用石墨烯接枝聚己內酯構建3D打印聚己內酯/石墨烯支架,證實石墨烯的添加對細胞活力和增殖具有積極影響。之后WANG等[58]將聚己內酯/石墨烯/脂肪來源干細胞移植入小鼠顱骨骨缺損,使用外源性微電流療法(10μA)體外刺激缺損處,通過蘇木精-伊紅染色、馬松染色觀察結締組織和新骨形成良好,堿性磷酸酶、β受體活化因子、β受體活化因子配體、骨保護素表達升高,證實電刺激聚己內酯/石墨烯支架對新骨重建起到積極影響。聚己內酯/磷酸三鈣也是聚己內酯復合支架的主要形式,如前所述[11,12,13]。

      2.3.3、 聚乙醇酸

      聚乙醇酸具有良好的生物相容性、降解性和良好的加工性,同時它具有良好的可塑性,在醫學領域廣泛應用。然而和聚乳酸一樣,聚乙醇酸的降解產物呈酸性,可引起局部組織的無菌性炎癥,需要對其進行優化處理以適應骨組織工程的要求。

      聚乙醇酸具有良好的可生物降解性和生物相容性,但細胞黏附性差。聚醚砜樹脂支架具有良好的生物力學性能,但生物相容性低。結合2種材料特征制備的聚乙醇酸/聚醚砜樹脂支架,是骨組織工程的常用類型,在此基礎上對聚乙醇酸/聚醚砜樹脂支架進行表面改性也會對脂肪來源干細胞成骨分化起到促進作用。KASHEF-SABERI等[59]利用靜電紡絲技術制成共電紡富血小板血漿/聚醚砜樹脂/聚乙烯醇復合支架,富血小板血漿添加后支架變得更有彈性,使支架有助于承受拉伸、扭曲和彎曲,堿性磷酸酶活性升高,茜素紅染色礦化結節增多,RUNX2、堿性磷酸酶成骨基因表達上調,證實富血小板血漿/聚醚砜樹脂/聚乙醇酸可有效促進脂肪來源干細胞的成骨分化。HEYDARI ASL等[60]探索增加物理刺激對聚乙醇酸/聚醚砜樹脂支架脂肪來源干細胞成骨分化的影響,用電磁波(12 MHz)刺激聚乙醇酸/聚醚砜樹脂/脂肪來源干細胞,堿性磷酸酶活性提高,RUNX2、堿性磷酸酶成骨基因表達增加,可見電磁場可有效刺激聚乙醇酸/聚醚砜樹脂支架上的脂肪來源干細胞成骨潛力。

      合成高分子材料可生物降解,具有良好的生物相容性。然而它們的其他性能如低親水性和低基質剛度,使其在細胞黏附和成骨分化方面不夠理想。支架表面結構作為細胞與支架之間的界面,在誘導干細胞成骨分化中發揮重要作用。因此,許多表面改性方法被用來改善支架的表面性能。通過對高分子材料進行復合材料改性及表面改性提高了其機械性能及成骨性能。

      高分子材料目前依然普遍存在的問題:降解產物呈酸性,會引起周圍組織的無菌性炎癥反應,依然缺乏從酸性產物及炎癥方面進行相應探討的研究;對高分子材料降解時間的研究相對較少,已應用于臨床的高分子材料降解時間跟蹤報道依然不足,需要進一步的動物實驗及臨床研究驗證,以及進一步研發降解可控的改性高分子材料。

      2.4、 支架空間結構

      傳統的支架材料多為2D支架,即二維平面支架材料。2D支架制作簡單,但2D支架很難模擬體內真實的環境,且干細胞在2D支架培養對增殖分化也會產生負面影響。目前骨組織工程更傾向于制備與臨床更貼合的3D支架[61]。

      隨著3D打印技術的發展,3D支架在骨組織工程有了更大的發展,鈦、β-磷酸三鈣、聚乳酸等材料都可應用3D打印技術制備三維材料。3D打印是一種借助三維CT數據獲得精確外形的材料制作技術,所制備外形更精確,使修復骨組織缺損獲得更理想的效果,在骨組織工程具有廣闊的前景。選擇性激光燒結和熔融沉積成型技術是骨組織工程最常用的加工方式,前者更適合打印多孔仿生支架材料,且要求材料必須以粉末形式獲得,其打印材料更加精確;后者設備體積更小,打印成本更低,是個性化3D打印的首選[62]。3D打印結合支架材料改性有望制備出個性化、精確形狀、成骨優良、機械性能適合的支架材料。

      3D支架材料的研發依然存在以下問題:制作成本較貴,個性化應用推廣存在困難;不同材料修復骨缺損所需最佳孔隙率和孔徑依然不能達到共識;支架材料的改性結合干細胞與3D打印技術融合的研究依然不足;如何實現3D支架材料的血管化問題尚需進一步研究;3D支架材料中添加活性因子促進成骨需要更多的研究資料進行驗證。3D支架材料在骨組織工程的發展具有廣闊的前景,但同時存在巨大挑戰。

      3、 小結與展望Conclusions and prospects

      骨組織工程是一項迅速發展、不斷革新的課題,以干細胞生物學和材料研究領域為主的骨組織工程正在蓬勃發展。脂肪來源干細胞在這一領域具有巨大的潛力,它的豐富性及易于獲取的優勢較其他干細胞更加明確。自骨組織工程出現以來,設計能與細胞相互作用以指導其生物反應和骨分化的材料研究一直層出不窮,如何營造更安全、更合理、更貼近生物體內細胞的生長微環境仍然面臨著很多困難;同樣支架材料對脂肪來源干細胞成骨誘導之外的血管化及植入后的感染也是需要關注的問題。脂肪來源干細胞分化為內皮細胞的能力及支持其分化的支架,在支架設計過程中加入抗感染因素,是未來骨組織工程支架材料可以展開的方向。

      作者貢獻:張圣敏進行綜述設計、資料收集及成文,劉超審校。

      經費支持:該文章接受了“臨床醫學科技創新計劃(201805052)”“滄州市科技計劃項目(183302068)”的資助。所有作者聲明,經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。

      利益沖突:文章的全部作者聲明,在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。

      寫作指南:該研究遵守《系統綜述和薈萃分析報告規范》(PRISMA指南)。

      文章查重:文章出版前已經過專業反剽竊文獻檢測系統進行3次查重。

      文章外審:文章經小同行外審專家雙盲外審,同行評議認為文章符合期刊發稿宗旨。

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