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    骨血管再生成種子細胞的處理及應用綜述

    時間:2018-10-30 來源:醫學綜述 作者:趙勝利,史本超,高浚淮 本文字數:10222字

      摘    要: 一直以來, 大段骨缺損的修復是骨科臨床的難題之一。采用組織工程學方法, 構建搭載成血管潛能種子細胞的組織工程骨可以實現材料內部早期血管化, 為成功修復大段骨缺損提供了新思路。目前, 具有成血管潛能的種子細胞來源多樣, 各具優勢。共培養和預處理技術的應用實現了細胞-細胞、細胞-微環境之間有效的信息交流, 定向誘導種子細胞向內皮細胞分化;運用基因編輯及基因轉染技術對種子細胞進行特定改造, 使其精確表達促血管生長因子, 達到“1+1> 2”的效果。同時, 種子細胞在定向誘導的過程中存在來源有限、耗時較長、目的蛋白表達低下等不足, 細胞-細胞、細胞-微環境之間作用的具體分子學機制尚不清楚, 經特定基因轉染后的種子細胞的安全性及有效性缺乏長期觀察, 仍有待于今后深入探索。

      關鍵詞: 組織工程; 骨缺損修復; 血管化; 種子細胞;
     

    骨血管再生成種子細胞的處理及應用綜述

     

      Abstract: The repairment of large segment bone defect has always been one of the challenges in orthopedic clinic.Tissue engineering method is used to construct tissue engineering bone with vascular potential seed cells which can realize early vascularization within the material and provides a new idea for successful repair of this kind of bone defect. At present, the seed cells with vascular potential have various sources and advantages;The application of co-culture and pretreatment technology realizes the effective exchange of information between cell-cell and cell-microenvironment, which can induce the differentiation of seed cells to endothelial cells;The gene editing and gene transfection technology were used to modify the seed cells in order to express exactly the vascular growth factor and achieve the effect of "1 + 1 > 2". At the same time, in the process of directional induction, for seed cells there are some problems, such as limited source, time consuming, low expression of interest protein, etc. The specific molecular mechanism of cell-cell, cell-microenvironment interaction remains unclear. The safety and effectiveness of seed cells transfected with specific genes are not observed over a long period of time. All these problems remain to be explored more deeply in the future.

      Keyword: Tissue engineering; Bone defect repairing; Vascularization; Seed cells;

      骨科在治療創傷、腫瘤、感染、先天性畸形等疾病時常造成大段骨缺損, 若缺損達到骨組織自我修復極限, 稱為臨界骨缺損[1]。組織工程骨在修復較小尺寸骨缺損時展現出良好的應用前景, 但在修復較大骨缺損時, 因骨質內部缺乏完善的脈管系統, 機體僅能通過滲透作用為工程化骨周邊提供營養物質 (葡萄糖、氨基酸等) 及氧氣, 運輸骨細胞、代謝廢物 (乳酸、尿素等) 及二氧化碳, 常導致中心部位壞死區的形成, 限制了組織工程骨的臨床應用范圍[2,3]。到目前為止, 具有完整脈管系統的自體骨塊仍是治療大面積骨缺損的最佳填充材料。隨著再生醫學的發展, 具有成血管潛能的種子細胞作為構建組織工程骨血管網的基本要素之一, 對于實現組織工程骨成功修復大段骨缺損的意義重大, 其功能和特性也越來越受到相關領域學者的重視。目前, 國內外眾多學者報道利用種子細胞實現了不同材料內部早期血管網絡的形成, 但所用種子細胞的種類、誘導方法不盡相同[4,5,6,7,8]。現就目前組織工程骨血管化中種子細胞的選擇、一般處理方法、存在的問題進行綜述, 并對未來的發展方向作一展望。

      1、 具有成血管潛能種子細胞的選擇

      實現組織工程骨血管化的種子細胞應具有來源廣、易獲得、低抗原性、高增殖力等特點。20世紀70年代, Friedenstein等[9]首次報道了骨髓間充質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) , 該細胞具有容易純化、體外培養要求低、低抗原性、擴增迅速等優勢。王志紅等[10]通過建立小鼠皮膚缺血模型研究BMSCs對缺血組織的修復作用發現, 皮下注射BMSCs組小鼠皮膚缺血狀態明顯改善, 免疫蛋白印跡法顯示Wnt/β聯蛋白 (β-catenin) 信號通路上游激活蛋白Wnt1和β-catenin在損傷部位高表達。國外研究也證實, 經典Wnt信號通路在促進新骨生成和血管新生方面發揮重要作用[11]。

      BMSCs發現較早, 具有干細胞的一般特征, 但有研究報道體內BMSCs儲量相對較低, 不能滿足臨床應用的需求[7]。隨后人們發現了脂肪干細胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) , 與BMSCs不同, 脂肪組織中ADSCs的濃度是骨髓中BMSCs濃度的100~300倍, 豐富的來源使之成為近年來干細胞研究的熱點[12]。已有研究證實, ADSCs在一定誘導條件下能分泌堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 、血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 、血小板源性生長因子、基質細胞衍生因子1等活性成分, 參與組織器官的發育、促進血管形成、支持造血、抗凋亡及加速細胞增殖[13,14]。

      隨著干細胞研究的深入, 人們從牙髓組織中成功分離出牙髓干細胞 (dental pulp stem cells, DPSCs) 。為檢驗DPSCs的血管生成能力, Marchionni等[4]向培養基中添加VEGF, 7 d后透射電鏡觀察到新生細胞內出現了常存在于內皮細胞胞質中的胞飲小泡, 基質膠中培養形成了大量類似原始毛細血管樣結構;流式細胞術檢測發現VEGF受體 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 、細胞間黏附分子1和血管性血友病因子 (von willebrand factor, vWF) 等內皮細胞標記表達于細胞表面。Alge等[15]將BMSCs和DPSCs進行比較發現, DPSCs表現出更短的倍增時間和更高的礦化活性, 提示DPSCs在誘導成骨成血管方面具有獨特的優勢和前景。國內外學者對內皮祖細胞 (endothelial progenitor cells, EPCs) 、羊膜間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、尿源性干細胞等不同來源的種子細胞展開研究, 通過一定方法誘導, 證實其均可向血管樣結構分化[16,17,18,19,20]。

      2、 種子細胞的一般處理方法

      2.1、 共培養

      血管生成是一個極其復雜的過程, 需要細胞和生長因子的共同參與。細胞間通過縫隙連接實現信息的有效傳遞, 通過旁分泌促進自身及周邊細胞的更新和定向分化[13,21]。為模擬微環境下細胞與細胞、細胞與外基質間的相互作用, 提高細胞定向誘導能力, 共培養技術得到廣泛應用。有研究表明, 共培養條件下, ADSCs通過縫隙連接與內皮細胞交換調節信號, 提高了微脈管形成率[22]。Deveza等[23]發現, 單純利用間充質干細胞 (mesenchyma stem cells, MSCs) 培養過程中產生的上清液就可以發揮促進內皮細胞存活和遷移的作用, 在培養過程中MSCs通過旁分泌作用向基質中釋放某些信號分子或生長因子, 進而造成內皮細胞生物學行為的改變。利用共培養的優勢, Kang等[5]將人臍靜脈內皮細胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 接種到預先培養的人MSCs薄片上, 然后將其包裹于β-磷酸三鈣支架表面, 制成含“骨膜”結構的人工骨, 體外培養3 d可見支架表面形成毛細管網狀結構;將支架移植入裸鼠背部皮下, 8周后可見支架血管與宿主血管廣泛連通, 支架骨化程度也顯著提高。關于MSCs與HUVECs共培養條件下促進成骨成血管的機制, 劉春曉等[24]認為, 在此條件下MSCs通過旁分泌產生的VEGF作用于內皮細胞, 提高了內皮細胞的增殖和血管形成效應, 同時MSCs可誘導內皮細胞產生骨形態發生蛋白2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2) , 促進自身向成骨細胞轉化。Paul等[25]認為由血管新生活性因子Slit3和血管內皮細胞跨膜蛋白受體Robo4共同組成的Slit3-Robo4信號通路在MSCs與HUVECs的相互作用中起到關鍵作用。

      2.2、 預處理

      細胞處在動態變化的微環境中, 理化因素共同參與其生物學行為的調節。細胞接受應力刺激, 通過微絲微管傳遞給細胞核, 導致核內特定基因的表達增強, 并在此過程中產生一系列生化反應。有文獻報道, EPCs在血流剪切力的持續作用下可向內皮樣細胞分化[26]。Melchiorri等[6]為進一步探究EPCs在外力作用下的生物學改變, 將預先制作的接種有EPCs的己內酯丙交酯血管模型連接于可模擬人體血流的體外三維灌注系統, 分別于3、7、14 d檢測細胞表面標志物表達情況, 可見動態環境下培養的EPCs增殖較靜態培養更為明顯, 原始細胞標志物CD34表達低于靜態培養組, 而成熟內皮細胞標志物CD31、vWF的表達高于同時期靜態培養組, 實驗表明, 持續流體灌注的動態培養條件加速了EPCs的增殖并向功能性內皮細胞的定向分化。Steward等[27]將MSCs與內皮細胞按照1∶1的比例共培養于成骨-成血管誘導培養基, 利用Flexcell細胞組織力學培養系統產生10%的循環拉伸外力, 觀察到在應力條件下共培養組礦物質沉積較對照組 (未施加應力或未共培養組) 明顯增多, 但研究未發現內皮細胞標志物CD31、血管內皮鈣黏蛋白有明顯變化。盡管未檢測到明顯的血管形成, 但研究認為, 持續的拉伸外力增強了MSCs產生VEGF的能力, 進而使內皮細胞中BMP-2基因表達增強, 促進了成骨作用。

      人體骨髓腔為相對低氧環境, 組織工程骨支架植入缺損部位后在其中心部位也常呈持續低氧狀態[2]。有研究報道, 適度的低氧環境可引發缺氧誘導因子1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1) 信號級聯反應, 通過下游蛋白的激活提高自身耐受能力和血管生成作用[28]。Liu等[7]為探究培養環境對干細胞表達VEGF和bFGF的影響, 采取低氧預處理ADSCs發現, VEGF和bFGF表達量高于對照組 (正常氧濃度組) , 實驗進一步將HUVECs加入細胞上清液, 發現其在基質上形成的毛細血管樣結構顯著多于對照組。陳鐵龍[29]將骨髓基質細胞在0.5%氧濃度下培養, 24 h后注射入心肌梗死動物模型心肌壞死區發現, 移植后24 h內經低氧預處理的MSC死亡率為70%, 而未經處理的MSC死亡率達到90%;且移植6周后發現, 低氧預處理組心肌梗死面積小于未處理組。王蘋蘋等[30]研究認為, HIF-1在低氧條件下維持MSCs的存活中起到關鍵作用。低氧條件下, HIF-1可介導細胞非氧化代謝途徑, 通過激活丙酮酸脫氫酶激酶 (pyruvate dehydrogenase kinase, PDK) 1編碼的PDK蛋白, 抑制三羧酸循環中乙酰輔酶A的合成, 從而降低細胞氧氣消耗, 以利于細胞在低氧條件下存活。同時, 低氧狀態可刺激MSCs上調VEGF的基因表達, 促進血管生長因子的釋放。

      2.3、基因編輯與基因轉染

      基因編輯技術對特定DNA片段進行剔除或加入, 實現對目的基因的改造。基因轉染技術是將某一遺傳信息通過一定方法傳遞到受體細胞, 使受體細胞穩定表達該遺傳信息。通過對特定遺傳信息的編輯修飾, 運用基因轉染方法實現對細胞的定向改造。Morita等[31]通過對內皮發育和血管發育重要的18個轉錄因子進行篩選發現, E-26轉錄因子 (E-twenty six, Ets) 家族中名為Ets變體2 (Ets variant 2, ETV2) 的轉錄因子可將原始的人皮膚成纖維細胞轉化成為功能性的血管內皮細胞。Pham等[8]利用編碼ETV2轉錄因子的信使RNA直接轉染表皮成纖維細胞, 低氧條件下培育14 d后檢測發現, 部分細胞表達與EPCs的表面標志物CD31和VEGFR類似, 小管形成實驗顯示其可在基質膠中形成與HUVECs相似的管樣結構。隨后, 將這些細胞注入下肢缺血小鼠模型, 發現實驗組小鼠肢體壞死程度、血流恢復情況及治愈率均高于對照組, 經信使RNA轉染后的表皮成纖維細胞成功轉化為EPCs, 同時低氧條件提高了成纖維細胞的轉化率。通過基因轉染方法改造細胞, 對彌補種子細胞在血管化過程中來源不足、培養效率低下等問題具有重要意義。

      缺血部位促血管生成因子 (如VEGF) 的釋放與濃度的升高具有明確的時間窗, 較低劑量表達無效, 而較高劑量表達常引起異常的血管生長[32]。有研究認為, 達到新生血管成熟穩定的促血管生長因子的表達至少需持續4周[33]。為解決缺血部位生長因子量不足及作用時間過短的問題, Spanholtz等[34]利用腺病毒載體搭載VEGF165和bFGF基因成功轉染成纖維細胞, 實現體內對VEGF和bFGF的持續活性遞送, 使VEGF持續高水平表達。有文獻報道, 病理狀態下VEGF蛋白持續升高可導致局部血管瘤形成[35]。為達到對生長因子釋放量及釋放時間的有效調控, Song等[36]利用基因編輯技術構建上游含9個串聯狀缺氧應答元件 (hypoxia response element, HRE) 和猿猴空泡病毒40的啟動子, 下游含編碼人VEGF基因序列的片段, 采用基因轉染技術成功將目的基因導入受體細胞。在缺氧條件下, 局部組織細胞合成的HIF-1蛋白與啟動子和增強子中HRE結合, 啟動并增強下游VEGF基因的轉錄, 使VEGF合成增加;在正常氧濃度條件下, 合成的大部分HIF-1被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解, 無法與含HRE的啟動子結合而啟動轉錄, 使VEGF合成減少。該方法有效避免了重組細胞局部持續合成釋放促血管生長因子的問題。

      3、 種子細胞應用過程中面臨的問題

      通過上述不同方法定向誘導改造種子細胞, 可以為組織工程骨內部早期血管化提供條件, 但同時在應用過程中仍存在一些亟待解決的問題: (1) 目前各類型干細胞分選、鑒定、體外培養缺乏統一標準, 干細胞在移植后是否存在致瘤作用尚存爭議[37]。有研究表明, 長期體外擴增干細胞、祖細胞等較低水平分化細胞可引起基因組不穩定和染色體畸變, 部分學者建議通過減少增殖量及傳代次數降低染色體畸變的風險[38,39]。 (2) 有研究報道, 共培養外周血來源的EPCs和MSCs復合摻鍶聚磷酸鈣多孔支架可實現良好的組織工程骨預血管化[40]。但有學者將MSCs單獨或與EPCs共同搭載于含可緩釋VEGF的聚乳酸-羥基乙酸微球的β-磷酸三鈣支架上, 8周后檢測發現, 共培養組支架中新生骨量少于MSCs組, 認為在構建組織工程骨支架修復骨缺損中加入EPCs的共培養是非必需的, 提示不同細胞在共培養過程中的相互作用原理尚需深入研究[41]。 (3) 經基因轉染后重組細胞的有效性、穩定性及安全性缺乏長期觀察。同時, 經腺病毒轉染宿主細胞存在轉染效率低下, 宿主細胞死亡率過高, 轉染后目標蛋白表達不足等問題[34,42]。通過熒光激活細胞分選技術, 可純化穩定轉染的種子細胞, 以提高遞送細胞因子的有效性和安全性。然而, 該方法耗費時間仍較長, 且需要體外大量擴增才能達到所需數量的細胞。

      4、 小結

      自1909年Maksimov首次發現造血干細胞以來, 對于干細胞的研究從未停止[43]。BMSCs、ADSCs、DPSCs等的陸續發現極大地豐富了組織工程骨血管化種子細胞的來源。利用不同種類干細胞的獨特優勢, 構建共培養體系, 采用低氧預處理、動態預處理、基因編輯與基因轉染技術, 實現對構建組織工程骨血管化種子細胞的多角度優化。但是, 種子細胞來源有限, 分離和提取缺乏國際標準, 定向誘導過程中的安全性和有效性也存在爭議。未來組織工程學針對種子細胞的研究應在探索不同細胞生物學行為異同的基礎上優化種子細胞的培養體系, 深入研究細胞-細胞、細胞-微環境、細胞-支架間的相互作用機制, 從而精準把握不同信號途徑對種子細胞生物行為的影響。通過技術革新, 提高種子細胞的轉染效率及成活率, 高效便捷地篩選符合條件的種子細胞, 也將成為未來研究的另一熱點。總而言之, 種子細胞作為組織工程學三要素之一, 具有基礎而重要的地位。隨著研究的深入, 利用成血管潛能種子細胞實現組織工程骨內部早期血管化將具有獨特優勢和廣闊的前景。

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