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    冬泳對大鼠解偶聯蛋白UCP基因表達的作用

    時間:2014-08-30 來源:未知 作者:小韓 本文字數:3133字
    論文摘要

      冬泳運動是利用機體可接受的冷刺激量來激發各系統功能向有利于自身健康的方面轉化,從而對機體各系統產生積極作用的冬季活動。冷刺激可以使脂肪細胞線粒體上的 UCP 表達增加。當機體感受到寒冷刺激時,解除了生理狀態下的抑制作用,使UCP 作用開通,致使氧化磷酸化產生熱能。解偶聯蛋白 UCP( uncoupling protein) 是線粒體陰離子載體蛋白家族中的成員,位于線粒體內膜。UCP 基因表達受多重調節,運動量、冷刺激以及 T3、視黃酸、胰島素等對 UCP 基因家族的表達都有影響。實驗只針對運動量、冷刺激進行大鼠解偶聯蛋白 UCP 基因的研究,為冬游運動的科學性提供理論依據。

      1 材料與方法

      1. 1 實驗動物及分組

      清潔級 SD 雄性大鼠 32 只( 購于吉林大學實驗動物中心) ,體重240 ~280 g。動物于 PLA-2 型自動送風養鼠籠中飼養,籠內溫度( 24 ±3) ℃,相對濕度40% ~ 60% ,自由飲食,飲水,照明隨同室內自然光變化。所用飼料為大鼠維持飼料( 購于吉林大學實驗動物中心) ,適應性飼養 10 d 后進行實驗。按照體重隨機將 32 只 SD 雄性大鼠分為四組: 安靜組A、3 min 游泳組 B,30 min 游泳組 C 和冬泳組 D,每組 8 只。

      1. 2 實驗動物模型制備

      3 min 游泳對照 B 組接受 6 周水溫 22 ℃ 的游泳訓練; 30 min 游泳 C 組接受適應訓練后,每天遞增 3min 至 30 min,冬泳 D 組接受適應訓練后,從 22 ℃水溫開始每天遞減 2 ℃,降至 8 ℃。大鼠均在長為100 cm,寬為 40 cm,水深為 60 cm 的水池中游泳,室內水槽自然狀態下水溫22 ℃,冬泳水溫控制采用水槽中加冰的方法每天降2 ℃,逐漸降水溫至8 ℃,游泳在每天上午進行,每周 6 d。

      1. 3 實驗動物取材

      各組大鼠均于運動后即刻進行乙醚麻醉,斷頭處死。各組均取大鼠右后腿股四頭肌肌肉置于10 mL離心管中,樣本取材后置于液氮中速凍,然后 -80 ℃保存。

      1. 4 主要試劑和儀器

      乙醚溶液500 mL,5 × TBE 濃縮儲液,0. 5 mol/LEDTA,溴化乙錠溶液 0. 5 mg / mL,氯仿,異丙醇,75% 乙醇,0. 1% DEPC 水,Trizol 試劑,吖啶橙染液,北京鼎國通用型 RT-PCR 試劑盒,山東產 202 型烘干箱,Germany MLE Z323K 臺式高速冰凍離心機,北京產 PLA-2 型自動送風養鼠籠,北京產 ECP3000 電泳儀,USA UVP GDS-8000 紫外凝膠成像系統,UKTECHNE FFG02HSD PCR 儀。

      1. 5 實驗方法
      
      骨骼肌 UCP 基因表達測定通過大鼠骨四頭肌深層肌肉 RNA 電泳結果、RT-PCR 反應電泳結果來反應 UCP 基因 mRNA 的相對表達量,在 RT-PCR 實驗中設置的內參照物是內源性參照物 β-actin,他在各種動物細胞內高度表達。UCP 基因參考 ChrisinaM. Evock-Clover 等設計的引物序列,其擴增長度為 389 bp,濃度為 20 D,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。UCP 引物序列 UCP forward:GTGGATGCCTACAGGACCAT,UCP reverse: ATGAA-CATCACCACGTTCCA。β-actin 引物序列 β-actin or-ward: TGCGTGACATCAAGGAGAAG, β-actin re-verse: TGCCAGGGTACATTGTGGTA。

      1. 6 數據處理與統計分析

      使用 SPSS17. 0 進行數據分析,組間比較使用一維方差分析,所有數值均用平均數 ± 標準差,P ﹤0. 01 表示差異極顯著。用 Alpha 紫外凝膠成像系統分析擴增片段大小。用 Lab words4. 0 分析軟件對RT-PCR 結果進行光密度分析。

      2 實驗結果

      2. 1 UCP 基因 RT-PCR 反應電泳結果

      大鼠股四頭肌深層肌肉 UCP 基因 RT-PCR 反應電泳結果見圖 1,結果顯示,冬泳訓練后大鼠股四頭肌 UCP/β-actin 的相對表達量結果在圖上清晰可見,UCP 基因在大鼠冬泳訓練后大鼠股四頭肌肌肉組織中表達,且條帶比較清晰、完整,UCP 的片段大小經分析約為 642 bp。【圖1.略】
      
      2. 2 RT-PCR 電泳各條帶凝膠密度分析結果

      骨骼肌 UCP 基因 RT-PCR 電泳凝膠密度分析結果顯示,UCP 基因在大鼠股四頭肌中表達,C 組、D 組與 A 組、B 組相比 UCP 基因的 mRNA 表達量有明顯增高趨勢,差異極顯著,且 C 組和 D 組之間的mRNA 表達量差異極顯著,見表  1。【表1】
    論文摘要
      
      3 討論

      UCP 在組織中分布廣泛,主要在骨骼肌、脂肪組織和心臟表達最為密切,機體的一切運動由骨骼肌發起,任何動作都會導致 UCP 表達變化。體外實驗證明,UCP 基因在轉染的酵母中過量表達可導致酵母線粒體膜電位降低,表明 UCP 具有解偶聯活性。UCP 是一個蛋白質家族,目前已發現的 UCP 有UCP1、UCP2、UCP3、UCP4、UCP5 和 UCP6。UCP 的作用機制是通過解偶聯作用降低細胞線粒體膜質子梯度,從而減少 ATP 生成,最終達到調節能量平衡的目的。UCP1 上要在棕色脂肪組織中表達,它的重要作用是調節脂肪的代謝,主要是通過驅散線粒體膜質子梯度來進行調節,當運動量增加到一定程度,需大量酯類參與功能,UCP1 表達增強,強度隨運動量增加而增強。

      運動量對 UCP 基因表達的影響。能量物質的氧化通過質子流與 ATP 的合成偶聯,質子電化學梯度在 F0-F1-ATP 合成酶作用下使 ADP 磷酸化,形成ATP。呼吸作用使氧消耗與 ADP 磷酸化形成 ATP相互偶聯,運動量增加導致耗氧量增大,啟動 UCP基因解偶聯機制。同時 UCP 基因在脂肪組織中表達,它的另一個重要作用是調節脂肪的代謝,通過驅散線粒體膜質子梯度進行調節,運動量增加到一定時間,就需要酯類物質參與供能,UCP 表達增強,強度隨運動量增加而增強。本實驗結果表明,C、D 組體酯含量極顯著低于 A、B 組。C、D 組大鼠泳后的 UCP 基因 mRNA 表達結果極顯著高于 A、B組,說明寒冷條件下的游泳和較大運動量的游泳均可使 UCP 基因表達增強,從而加強了機體的脂肪代謝。

      冷刺激對 UCP 基因表達的影響。冬泳運動可使動物通過調節自身體溫的基因進行表達,動物機體受到冷刺激后,加強自身的基礎代謝產生熱能。在冷環境刺激下,為了維護自身的體溫,需要更多的細胞通過 UCP 解偶聯產熱,使 UCP 質子通道打開,導致氧化磷酸化解偶聯而產熱,以熱能的形式散發出來。Vianna 等報道 UCP 基因參與產熱作用的調控。實驗結果表明,D 組大鼠泳后的UCP 基因表達顯著上調,極顯著地高于 A、B 組,且極顯著地高于 C 組,說明游泳運動可使 UCP 基因表達增強,在寒冷條件下的游泳運動更能加強 UCP 基因的表達,UCP 的數量和活性決定機體的產熱能力,當大鼠感受到冷刺激時,除正常生理應急抑制作用外,還可以使細胞 UCP 質子通道開放,致使機體氧化磷酸化作用解偶聯產生熱能。為使機體抵抗寒冷引起的機體體溫下降,需更多的細胞通過 UCP 解偶聯產熱,釋放更多的熱能。大鼠 UCP 基因的表達可能涉及到很多因素,如基因的結構、基因的轉錄、基因的翻譯等,其中每一個細小的環節都可使基因表達的改變,大鼠冬泳恢復后的 UCP 基因表達情況還有待于進一步的研究。

      4 結論
      
      寒冷條件下的游泳和較大運動量的游泳均可使UCP 基因表達增強,加強機體的能量代謝,24 h 后UCP 基因表達恢復到正常水平。冬游與較大運動量的游泳相比,運動后即刻大鼠骨骼肌 UCP 基因表達升高,大鼠機體在外界低溫的刺激下發生了誘導上調反應。

      參 考 文 獻
      
      1 楊成君,王 燦,尹忠偉,等. 冷暴露對大鼠機體能量代謝影響.中國公共衛生,2007; 23( 12) : 1469—1470
      2 蘇彥炬,霍少華,于動震,等. 冬泳和游泳運動對糖尿病大鼠病情影響的實驗對比. 中國臨床康復,2005; 9( 2) : 205—207
      3 Evock-Clover C M,Poch S M,Richards M P,et al. Expression of anuncoupling protein gene homolog in chickens. Comparative Biochemit-ry and Physilolgy Part A,2002; 133( 1) : 345—358
      4 Gimeno R E,Dembski M,Weng X,et al. Cloning and characterizationof an uncoupling protein homolog. Diabetes,1997; 46( 5) : 900—906
      5 Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosyntheticphosphorylation. Biol Rev Camb Philos Soc,1966; 41( 3) : 445—502
      6 朱萬龍,賈 婷,李宗翰,等. 冷馴化條件下大絨鼠的產熱和能量代謝特征. 動物學報,2008; 54( 4) : 590—601

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