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    探討MDA在運動性疲勞中的作用及Tau抗運動性疲勞機制

    時間:2014-05-24 來源:未知 作者:4號編輯 本文字數:6280字
    論文摘要
      紅細胞是血液基本功能的重要組成,紅細胞功能的異常直接影響到氣體的運輸及血液粘度,從而直接影響到機體的正常生理活動和運動能力。牛磺酸( Taurine,Tau) 又名為牛膽酸或牛膽素,是中藥牛黃的主要成分,化學名稱為 2 - 氨基乙磺酸( 2 - Amin-oethyanesulfonic acid) .國內外的學者對 Tau 的生理作用已經進行了充分的研究[1],其在抗氧化、緩解運動性疲勞[2 -4]和調節細胞穩態[5]方面發揮重要作用。在劇烈運動或者大負荷長時間過度訓練中,由于機體運動量加大,呼吸活動及物質代謝和能量代謝加速,自由基水平升高,自由基介導的脂質過氧化速率加快,脂質過氧化過程中會產生以丙二醛( Malondialdehyde,MDA) 為代表的許多含有 α-、β-不飽和醛酮類物質( 也叫 TBARS) ,這些物質在機體的衰老和疲勞過程中有重要的毒副作用[6 -7].Tau 作為一種抗氧化劑和自由基清除劑及其抗疲勞作用在細胞和動物水平已經有了充分的研究,結果表明,Tau 可降低劇烈運動導致的自由基水平升高[8],可顯著延長大鼠的游泳能力[9].
      
      以往研究人員在機體的抗氧化研究中,MDA 往往只認為是氧化應激水平的指標,而忽視 MDA 本身也是導致機體運動能力下降的原因及造成機體細胞結構功能損傷的重要因素[10].本研究通過比較過度訓練大鼠模型和喂食 MDA 大鼠,比較二者紅細胞在結構上的損傷性變化,采用 Tau 保護過度訓練大鼠與喂食 MDA 大鼠,通過掃描電鏡觀察其對紅細胞形態結構的影響,其對紅細胞溶血反應和膜脂流動性的影響,對紅細胞膜蛋白電泳特征的影響,探討 MDA 在運動性疲勞中的作用及 Tau在抗運動性疲勞中的可能機制。
      
      1 材料與方法
      
      1. 1 實驗動物與過度訓練方案
      
      40 只成年 SD 大鼠購自中南大學湘雅醫學院實驗動物中心,雌雄不限,體重 220 ~275 g.在我校實驗動物房中喂養 1 周后,行力竭運動3 d( 1 次/d) ,淘汰游泳能力最強的前5 只和游泳能力最差的后 5 只大鼠,余下 30 只隨機分成 6組,其中 A、B 組各 3 只,其余各組 6 只。A 組為自來水對照組,常規飼養,不加其它干預措施; B 組為 PBS對照組,常規飼養,以 PBS 代替自來水; C 組為喂食MDA 組,MDA 以 PBS 為溶劑配制; D 組為喂食 MDA +Tau 組,MDA 和 Tau 以 PBS 為溶劑配制; E 組為過度運動訓練組,常規飼養; F 組為過度運動訓練 + 喂食 Tau組,Tau 以 PBS 為溶劑配制。
      
      1. 2 研究方法
      
      1. 2. 1 游泳過度訓練方案
      
      篩選的 30 只 SD 大鼠休息飼養 3 d 后對 E、F 組進行 4 周負重游泳過度訓練,每周負重量依次為: 3% 體重、5% 體重、7% 體重、9%體重,每次游泳至力竭。力竭標準為大鼠頭沉入水下持續 10 s 以上,撈起后呈低頭俯臥位,呼吸深急。
      
      1. 2. 2 Tau 配制、MDA 的制備
      
      Tau 溶液的配制按照參考文獻[9]提供的方法配制。先將 Tau 溶解于 1N 的鹽酸中,然后用1N 的 NaOH 中和到 pH 7. 0 后,過濾除菌,最后用 PBS 配制成濃度為 10% 的 Tau 溶液。Tau喂食劑量為每 100 g 大鼠體重 10 mg( 即每 100 g 體重大鼠喂食 1 mL) .MDA 的制備按照文獻[11]提供的方法配制,用 TMP 制成 10 mM 濃度的 MDA,喂食劑量為每 100 g 大鼠 1 mL.
      
      1. 2. 3 儀器和試劑
      
      主要儀器有日本日電 JSM -2840 型掃描電鏡,日本 Hitachi F - 4500 型熒光分光光度計,美國 Bio-Rad 5070 型通用電泳儀。主要試劑有1,1,3,3 - 四甲氧基丙烷 ( 1,1,3,3 - tetramethoxypro-pane,TMP) ,DTT( 1,4 - dithiothreitol) ,DPH( 1,6 - di-phenyl - 1,3,5 - hexatriene) ,四氧化鋨( osmium tetrox-ide) 購自 Sigma 公司; 蛋白裂解試劑盒購自上海潤城生物科技公司; Tris,TEMED,SDS,Gly 等電泳用常規試劑購自 Amresco 公司,其它試劑購自上海生工生物工程公司;
      
      1. 2. 4 紅細胞掃描電鏡觀察樣品的制備
      
      處死大鼠從腹主動脈處收集全血,全血用10 倍體積的生理鹽水洗滌后,2 000 r/min 離心去上清,重復 2 次即得壓積紅細胞,圧積紅細胞加入到含 3% 的戊二醛的甲次砷酸鹽的緩沖液( pH7. 4) 中固定至少 1 h 后,植入預先包被有多聚賴氨酸的玻片,經 1% 的四氧化鋨固定后,乙醇梯度脫水,CO2臨界點干燥后于掃描電鏡下觀察。
      
      1. 2. 5 紅細胞膜的制備
      
      紅細胞膜按照依照 Dodge等的方法制備[12].紅細胞加入到在冰箱中預冷的生理鹽水中( 1: 9 體積比) ,離心( 2 000 r/min,5 min) 洗滌 3 次后,按照紅細胞與雙蒸水體積比 1: 9 的比例低滲裂解紅細胞,置 4 ℃ 冰箱中 3 h 后,離心( 6 000 r/min,10 min) ,去上清,用雙蒸水離心洗滌 4 ~ 5 次后,直到收集的紅細胞膜無紅色。最后將收集的紅細胞膜懸浮在 pH7. 4 的 PBS 緩沖液中備用。
      
      1. 2. 6 紅細胞膜流動性的測定
      
      制備的紅細胞膜按照按 Lowry 法[13]測定膜蛋白濃度,用 PBS 配成紅細胞膜懸液( 膜蛋白濃度在 300 ~350 mg/L) .取紅細胞膜懸液 2. 0 mL 加入含 DPH 濃度為 2. 0 × 10- 6mol / L 的PBS 2. 0 mL,在 25 ℃ 水浴 30 min 后,以激發和發射波長分別為 360 nm 和430 nm 測定計算各組熒光偏振度( P) ,P = ( Ivv-G × Ivh) / ( Ivv+ G × Ivh) ,G 為校正因子,G= Ihv/ Ihh.其中 Ivv為起偏器和檢偏器為垂直時的熒光強度; Ivh為起偏器為垂直和檢偏器為水平時的熒光強度; Ihv為起偏器為水平和檢偏器為垂直時的熒光強度; Ihh起偏器和檢偏器為水平時的熒光強度度。熒光偏振度( P) 與微粘度( η) 的定量關系[14]: η = P/( 0. 46 - P) .膜流動性用膜微粘度表示,膜微粘度越大,流動性越小。微粘度變化的數據為每組各動物 3次所測結果的平均值。
      
      1. 2. 7 紅細胞溶血度的測定
      
      各處理組紅細胞溶血度的測定參照文獻[15]的方法。即取各處理組大鼠血清,用分光光度法在 415 nm 處測定其吸光度; 正常大鼠壓積紅細胞放入 37 ℃蒸餾水中( 體積比為 1∶ 1) 1 h后,離心取上清,用分光光度法測定該上清吸光度。用紅細胞在蒸餾水中溶血后吸光度( 假設這時紅細胞的溶血度為 100%) 作對比算出各處理組紅細胞的溶血度。各處理組紅細胞溶血度變化的數據為每組各動物 3 次所測結果的平均值。
      
      1. 2. 8 紅細胞膜蛋白
      
      SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE) 按照 Laemmli 法進行[16],即取紅細胞膜樣品,經裂解后釋放膜蛋白,用 PBS 緩沖液稀釋到上樣蛋白濃度為 1. 0 mg/mL ( Lowry 法定量) .以7. 5% 的丙烯酰胺膠濃度,150 V 恒壓 60 min 電泳后終止。凝膠以考馬斯亮藍( R -250) 染色顯帶。
      
      1. 2. 9 數據分析
      
      本研究中給出的所有數據為平均值 ± 標準差。不同組間的比較采用 SPSS13 統計軟件進行方差分析( ANOVA) ,并用 Origin7. 5 軟件進行統計繪圖。P <0.05 代表統計學上有顯著差異,P <0. 01代表統計學上有極顯著差異。
      
      2 結 果
      
      2. 1 各不同處理組紅細胞掃描電鏡觀察
      
      紅細胞在受到環境異常刺激后,會出現各種不同異常形態。各處理組紅細胞按要求制備成樣品后,在掃描電鏡下觀察紅細胞的形態。結果如圖 1( 80 000 倍放大) .顯然,丙二醛和過度訓練導致了大鼠紅細胞形態的異常,而 Tau 對紅細胞形態的破壞有保護作用。
      論文摘要
     
      圖 A、B 為分別用自來水和 PBS 喂食的大鼠紅細胞,形態上為典型的雙凹圓餅狀; 圖 C 為喂食 MDA 大鼠的紅細胞,部分紅細胞出現異常結構; 圖 D 為喂食Tau 和 MDA 大鼠紅細胞,基本上為結構異常的紅細胞,少量紅細胞周圍出現毛刺; 圖 E 為過度訓練大鼠紅細胞,不僅結構異常,還出現聚集現象; 圖 F 為過度訓練大鼠同時喂食 Tau 后的紅細胞,結構大多完整,且為雙凹圓餅狀。
      
      2. 2 各不同處理組大鼠紅細胞膜流動性的變化
      
      紅細胞膜的流動性是紅細胞發揮其運載功能的重要生理基礎。紅細胞膜的流動性以紅細胞膜的微粘度來表示,紅細胞膜微粘度升高,表明其流動性降低,紅細胞變形性下降,是紅細胞膜受損的重要指標。各不同處理組大鼠紅細胞微粘度 η 的變化如表 1 所示。
      
      與對照組( A 和 B) 比較,其余各不同處理組大鼠紅細胞微粘度升高,流動性降低,且都表現出顯著或極顯著差異。C 組大鼠喂食 MDA 后導致紅細胞微粘度升高,流動性降低,與同時喂食 MDA 和 Tau 的 D 組大鼠比較,D 組大鼠紅細胞膜微粘度降低,流動性升高,它們之間存在顯著差異( #P < 0. 05) ; E 組大鼠在劇烈運動后其微粘度升高,與劇烈運動同時喂食 Tau的 F 組比較,后者的微粘度降低,細胞膜流動性升高,它們之間也表現出了顯著差異( %P <0.05) .
     
      論文摘要
     
      2. 3 各不同處理組大鼠紅細胞溶血度的變化在紅細胞處于應激狀態下,紅細胞膜的結構會發生改變,導致膜的完整性變差,紅細胞膜容易破裂導致紅細胞易于溶血。各不同處理組大鼠紅細胞的溶血度變化如表 2 所示。
      
      與對照組( A 組和 B 組) 比較,各種不同處理都導致紅細胞溶血度升高,但不管是喂食 MDA 組后再喂食 Tau( C 組與 D 組比較) 或力竭運動后再喂食 Tau( E組與 F 組比較) ,都可顯著降低紅細胞的溶血度,顯示Tau 能拮抗 MDA 或力竭運動所致的紅細胞膜的損傷。
     
    論文摘要
     
      2. 4 各不同處理組大鼠紅細胞膜蛋白凝膠電泳結果為進一步研究各不同處理對大鼠紅細胞膜蛋白的影響,用生理鹽水洗滌各組的壓積紅細胞后,按1.2. 5 的方法制備紅細胞膜,紅細胞膜用蛋白裂解試劑盒裂解后,經 SDS-PAGE 凝膠電泳,結果如圖 2 所示。泳道 1~ 6 分別為 A ~ F 組大鼠紅細胞膜蛋白在 SDS-PAGE中電泳的行為,泳道 1 和2 沒有出現新的電泳條帶,而其它各處理組都出現了高分子量聚集的新電泳條帶( high molecular weight aggregation,HMWA) ,說明各種不同的應激都將導致紅細胞膜蛋白結構的變化。
     
      論文摘要
     
      3 討 論
      
      MDA 作為自由基介導的脂質過氧化和非酶糖基化過程所產生的 α-、β-不飽和醛酮類物質的代表性中間產物[17],其對機體正常生理功能和穩態的破壞作用已被越來越多的科學工作者所重視[18 -20],甚至認為MDA 是導致機體運動性疲勞的重要“疲勞因子”[20].
      
      牛磺酸作為一種非蛋白氨基酸,在臨床醫學和運動營養學上廣泛用于調節機體正常生理功能和增強機體對抗各種應激狀態的能力,以人和動物為模型對 Tau在抗運動性疲勞的作用和對紅細胞 ATPase 活性的保護作用已有廣泛的研究[9,22].然而 Tau 在抗疲勞中的生化機制并不十分明確。
      
      機體在劇烈運動或大負荷長時間訓練后,都會導致體適能的下降,而紅細胞運載功能的下降與機體這種體適能的下降是密不可分的。由于紅細胞長時間處于高氧分壓環境,在劇烈運動或大負荷長時間的訓練后,活性氧會引發紅細胞膜脂成分的脂質過氧化,脂質過氧化反過來又會產生新的活性氧 自由基( ROS) ,在該過程中會產生大量的 MDA 等不飽和活性醛酮類物質[17,20],如此循環往復即脂質過氧化的放大過程加大對紅細胞膜結構的損傷。在本研究中,在大鼠喂食 MDA 后紅細胞形態發生了改變( 圖 1C) ; 在紅細胞膜流動性的實驗中同樣 MDA 喂食大鼠紅細胞膜微粘度升高( 表 1C 組) ,且與對照組之間有極顯著差異; 在紅細胞溶血度實驗中,MDA 喂食大鼠紅細胞膜溶血度升高( 表 2C 組) ,與對照組間有顯著差異。
      
      而 Tau 的喂食,則在很大程度上能逆轉 MDA 的這些作用( 圖 1D,表 1D 組和表 2D 組) ,表現了 Tau 的抗MDA 作用。已有的研究表明,在人或動物運動性疲勞時 MDA 的水平也顯著升高[23 -24],升高的 MDA 會攻擊細胞膜上的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等不飽和脂肪酸中的不飽和雙鍵,進一步破壞細胞膜的脂雙層結構,MDA 的這種作用可能是導致運動性疲勞的重要原因之一。從形態上觀察,在 MDA 的作用下和過度訓練大鼠,其紅細胞形態都明顯異常,出現了許多非典型形態的紅細胞( 圖 1C、1E) ; C 組和 E 組大鼠在紅細胞膜流動性降低和紅細胞的溶血度升高,在喂食 Tau作用后,都能逆轉對紅細胞的損傷,提示二者在導致紅細胞膜結構破壞上可能存在共同的生化機制。在喂食 MDA 和 Tau 的 D 組及過度訓練同時喂食 Tau 的F 組,其紅細胞膜的結構明顯得到保護,與相應的對照組比較紅細胞膜的流動性升高,其溶血度也降低。楊愛華等[9]的研究也表明,Tau 的補充能明顯延長動物力竭運動時間,其中的生化機制可能與 Tau 抗 MDA 的作用密切相關。
      
      紅細胞膜的蛋白成分,主要有細胞骨架蛋白( 血影蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白等) 、血型糖蛋白、離子通道蛋白和轉運蛋白( 如 Na-K-ATPase) 等,其在細胞膜中含量有高有低,分子量有大有小。由于 MDA 的分子結構中含有 2 個醛基的雙功能基團,能與蛋白質中的 α-NH2以形成 Shiff's 堿形式共價加成,在分子結構上會導致蛋白質間 ( 或者蛋白質內) 的分子交聯[25 -26],因此在 SDS-PAGE 電泳條帶上能產生大分子量的新的電泳條帶。圖 2 清楚地顯示,喂食 MDA 組大鼠和過度訓練疲勞大鼠紅細胞蛋白電泳中都出現了高分子量條帶 ( high molecular weight aggregation,HMWA) ( 圖 2 條帶 3 和條帶 5) .這些 HMWA 條帶的形成是紅細胞膜上的各種蛋白質在丙二醛的交聯作用下,它們之間以 Shiff's 堿形式共價加成聚集而成的大分子物質,因此在 SDS-PAGE 電泳圖上顯示出新的條帶。而在喂食 Tau 后,這些的新的 HMWA 條帶蛋白聚集量減少,推測由于對紅細胞蛋白的損傷減少,顯示了 Tau 在拮抗由于 MDA 作用或過度訓練所導致的對紅細胞膜蛋白損傷的保護作用。
      
      4 結 論。
      
      不管是喂食 MDA 或過度訓練都可導致紅細胞形態和結構的損傷,從而降低紅細胞的運載功能,這是導致大鼠運動能力下降和運動性疲勞的原因之一。Tau 的補充則可對紅細胞膜起保護作用,從而提高運動能力,提示 Tau 在抗運動性疲勞中的生化機制可能是通過拮抗 MDA 對紅細胞的損傷而發揮作用。
     
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