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    生豬不同養殖方式下動物源細菌耐藥性探究

    時間:2016-05-09 來源:動物醫學進展 作者:孫理云,劉志軍,周博 本文字數:5283字
    摘要

      集約化養殖導致食品動物抗菌藥物的廣泛使用,造成動物源細菌耐藥性不斷上升,也出現了很普遍的多重耐藥菌甚至泛耐藥菌。動物源細菌耐藥性不僅會導致治療失敗,直接影響動物的健康和福利[1],也已成為公共衛生的一種重要威脅,為全球普遍關注的公共衛生問題,因而近年來人們加強了對動物源細菌的抗菌藥物抗性的監測[1]。

      監測的細菌通常包括人獸共患病病原菌、獸醫病菌和指示菌[2]。監測革蘭陽性菌耐藥性的指示菌常選腸球菌,革蘭陰性菌耐藥性的指示菌為大腸埃希菌。選這些細菌為指示菌是由于其作為人和動物的主要共生菌無處不在,應對抗生素選擇性壓力可獲得耐藥性,它們能將耐藥性轉移給致病菌及共生菌間轉移耐藥性[3]。

      治療豬細菌性疾病常用的抗菌藥物包括β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氯霉素類、氟喹諾酮類和葉酸拮抗劑等,因而細菌耐藥性的監測常為對這些種類藥物耐藥性監測,以期了解和掌握動物源細菌耐藥性產生及擴散程度,利于獸醫臨床合理選擇和使用抗菌藥物。

      1、材料與方法

      1.1、材料

      1.1.1、試驗菌株

      2015年4月分離自河南省洛陽市某豬場健康豬糞樣,其中生產母豬大腸埃希菌菌株10株,分別為S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10和S11,育肥豬大腸埃希菌菌株17株,為Y1、Y2、Y3、Y5、Y6、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y16、Y17、Y18和Y20,保育豬大腸埃希菌菌株8株,為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8。另有從2個散養戶養殖的健康育肥豬分離的大腸埃希菌菌株6株,分別為C1、C2、C3、C4、C5和C6。藥敏試驗質控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

      1.1.2、主要培養基和試劑

      營養瓊脂培養基、MH培養基,杭州天和微生物試劑有限公司的產品;營養肉湯培養基,北京雙螺旋微生物培養基制品有限公司產品。抗菌藥物藥敏紙片5類11種,分別為β-內酰胺類的氨芐西林(Amp,10μg/片,批號:150407)、阿莫西林/棒酸 (Amc,20μg/10μg/片,批號:150324)和頭孢噻肟(Ctx,30μg/片,批號:150116),氟喹諾酮類的萘啶酸(Na,30μg/片,批號:150127)、恩諾沙星(Enr,15μg/片,批號:150205)和氧氟沙星(Ofl,5μg/片,批號:150123),葉酸合成抑制劑類的復方新諾明(Sut,23.75μg/1.25μg/片,批號:150210),四環素類的四環素(Tet,30μg/片,批號:150206)和強力霉素(Dox,30μg/片,批號:150324),氨基糖苷類的慶大霉素(Gen,10μg/片,批號:150104)和大觀霉素(Spt,100μg/片,批號:150303),杭州濱和微生物試劑有限公司產品。

      1.2、方法

      1.2.1、藥敏試驗

      采用臨床與實驗室標準協會(CLSI)推 薦 的Kirby-Bauer紙 片 瓊 脂 擴 散 法 進行[4]。從營養瓊脂平板上挑取3個~5個形態特征一致的菌落,用接種環將細菌轉移到含5mL適宜的肉湯培養基中。將肉湯培養物置37℃孵育12h。

      將菌液均勻涂布于MH瓊脂平板。涂布細菌后15min之內在瓊脂表面置放藥敏紙片。紙片貼好后15min內將平板倒置于37℃培養,16h~18h測定抑菌圈直徑,細菌耐藥性參照CLSI(2012)標準判定。

      1.2.2、數據處理分析。

      將對檢測某藥具抗性或中介的菌株歸為耐藥菌株;不同來源菌的耐藥率為耐藥菌株數與檢測菌株數之比。

      大腸埃希菌抗菌藥物耐藥率,按照公式:A/Bxl00%來計算,A表示某種豬源大腸埃希菌耐藥菌的數量;B表示某種豬源大腸埃希菌所有菌株的數量。計算不同來源菌的多重耐藥指數:MARI=a/bc,其中a為代表某來源細菌的總抗菌藥物耐藥值,b代表檢測的抗菌藥物種類數目,c代表某來源細菌菌株數,0<MARI<1,MARI值越大說明多重耐藥水平越高[5]。

      2、結果

      2.1、多重耐藥指數

      由表1可見,散養豬源菌的MARI最 小,為0.12。集約化養殖場豬源菌的MARI為0.57,其中母豬源菌最高,為0.64,保育豬源菌次之,為0.55,育肥豬源菌再次之,為0.53。

    表1 不同生長期豬源大腸埃希菌的多抗菌藥物耐藥指數
    表1 不同生長期豬源大腸埃希菌的多抗菌藥物耐藥指數

      2.2、耐藥率分析

      不同生長期的豬源大腸埃希菌對11種所測抗菌藥物的耐藥水平如表2所示。

    表2 不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥水平
    表2 不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥水平

      散養育肥豬源菌僅對Tet有很高水平的耐藥性,對Amp和Dox 3種抗菌藥物有高水平的耐藥性,對其余8種抗菌藥物無耐藥性,均敏感。集約化養殖場豬源菌中,無論是保育豬源菌,育肥豬源菌還是母豬源菌,對Amp、Tet和Dox都具有極高的耐藥性,耐藥率80%~100%;此外,保育豬源菌和母豬源菌對Sut也有極高的耐藥性,育肥豬源菌對其有很高的耐藥性。對其余7種藥物,保育豬源菌,育肥豬源菌和母豬源菌的耐藥性不盡相同。保育豬源菌對Spt的耐藥水平極高,對Ctx、NA和Gen耐藥水平很高,耐藥率范圍37.5%~50%;對其余3種抗菌藥物耐藥率為0。育肥豬源菌對Ctx、和NA耐藥性很高,對Enr、Ofl、Gen和Spt耐 藥 高 性,耐 藥 率 范 圍23.5% ~41.2%;對Amc無耐藥性,均敏感。母豬源菌對Ctx、NA、Gen和Spt有很高的耐藥性,耐藥水平60%~70%;對Enr、Ofl耐藥水平高,均為30%的耐藥率;對Amc也無耐藥性,均敏感。

      2.3、交叉耐藥分析

      不同生長期的豬源大腸埃希菌對β-內酰胺類的氨芐西林、阿莫西林/棒酸和頭孢噻肟,氟喹諾酮類的萘啶酸、恩諾沙星和氧氟沙星,四環素類的四環素和強力霉素,氨基糖苷類的慶大霉素和大觀霉素交叉耐藥結果見表3。

    表3 不同生長期豬源大腸埃希菌的交叉耐藥情況
    表3 不同生長期豬源大腸埃希菌的交叉耐藥情況

      集約化養殖場豬源菌中,100%保育豬源菌交叉耐藥菌,交叉耐1類藥菌株最多,有B1、B2、B6、B7和B8五株;交叉耐3類藥菌株為B3、B4和B5。在8株保育豬源菌中,交叉耐Tet和Dox最為嚴重,100%菌株交叉耐Tet和Dox;交叉耐Amp和Ctx和交叉耐Gen和Spt菌株比率一樣,均為37.5%菌株,均為B3、B4和B5菌株。

      17株育肥豬源菌82.4%交叉耐藥,其中交叉耐1類藥菌株最多,5株分別為Y6、Y9、Y10、Y15和Y16,交叉耐2類藥菌株有Y3、Y5、Y17和Y20;交叉耐3類藥菌株有Y1和Y8;交叉耐四類藥菌株最少,為Y11、Y12、Y13和Y20。育 肥 豬 源 菌 中,52.9%交叉耐耐Tet和Dox,菌株數最多;交叉耐喹諾酮類的菌株次之,其中23.5%菌交叉耐NA、Enr和Ofl,5.9%菌交叉耐NA和Enr;17.6%菌株交叉耐Amp和Ctx,11.8%交叉耐Gen和Spt,相應菌株見表3。

      90%母豬源菌交叉耐藥,其中交叉耐1類藥菌株S5、S6,交叉耐2類藥菌株有S7、S8和S10共3株,交叉耐3類的有S1、S3和S7,交叉耐4類的有S2、S11。10株 母 豬 源 菌 中,80%交 叉 耐Tet和Dox,50%交叉耐Gen和Spt,70%菌株交叉耐Amp和Ctx,30%菌株交叉耐NA、Enr和Ofl。33.3%散養育肥豬源菌交叉耐Tet和Dox。

      2.4、耐藥譜及多重耐藥性分析

      41株細菌共有19種不同的耐藥模式,從耐藥譜多樣性來看,母豬分離菌最大,10株菌有7種耐藥譜;17株育肥豬源菌有耐藥譜12種;保育豬分離菌耐藥譜多樣性最小,8株菌有4種耐藥譜(表3)。10種耐藥模式有2株及以上的菌株,同一集約養殖場不同生長階段的豬源大腸埃希菌有菌株具有同樣的模式,散養豬源大腸埃希菌和集約化養殖場的豬源大腸埃希菌菌株有些也具相同的模式(表4)。

      按照Magiorakos A P等[6]的多重耐藥腸桿菌科細菌定義,耐3類及以上的腸桿菌為多重耐藥菌,測定的41株細菌,散養豬源菌的耐藥模式均非多重耐藥模式,多重耐藥菌均屬集約化養殖場豬源細菌,有13種耐藥模式,其中共有Amp-Tet-Sut模式,占集約化養殖場豬源菌82.9%(29/35)。共耐頭孢噻肟-恩諾沙星菌株有9株,母豬源菌3株、育肥豬源菌6株。

      多重耐藥模式中以耐5類藥的占絕對優勢,有8種模式,其中耐6種藥的模式有1種,耐7種藥的模式有3種,耐8種藥的模式有2種,耐9種藥的模式有1種,耐11種藥的模式有1種。

      耐4類藥的菌株有4種模式,其中耐4種藥的模式有1種,耐5種藥的模式有1種,耐7種藥的模式有2種。耐3類藥的菌株有1種模式。

      集約化豬場分離菌優勢耐藥模式為Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA-Enr-Ofl、Amp-Ctx-Tet-Dox-Sut-Gen-Spt-NA和Amp-Sut-Tet-Dox,菌株數均占檢測的集約化豬場分離菌數的14.3%(5/35)

    表4 不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥模式
    表4 不同生長期豬源大腸埃希菌的耐藥模式

      3、討論

      本試驗所測菌株均分離自一豬一樣,一樣一株菌,避免菌株來自同一克隆,因而基本代表了調查豬場豬源大腸埃希菌基本狀況。

      MARI是分析某部位指定菌群如大腸埃希菌耐藥性的 極 佳 工 具。菌 株 暴 露 于 常 用 抗 菌 藥 物,MARI>0.2,而少用或從不用抗菌藥物,MARI<0.2[7]。基于MARI計算結果,散養育肥豬源菌的MARI<0.2,說明這些豬很少用或從沒用過抗菌藥物,這與我們詢問飼養者的結果一致。集約化豬源菌的MARI為0.57,與Su H C等調查華南家畜糞腸桿菌的MARI值0.56結果相近[8]。

      我們調查的散養小豬場,僅養殖育肥豬,實行“全進全出”;喂養的飼料均為養殖戶自行加工,未添加任何藥物添加劑,加之所養豬不曾發病,未采用抗菌藥物治療,因而其大腸埃希菌不曾受到任何抗菌藥物壓力的選擇。分離的大腸埃希菌對臨床常用的5大類11種抗菌藥物的耐藥性只對使用歷史較久的抗菌藥物Amp、Tet和Dox有一定的耐藥性,而對其余8種藥物均100%敏感,這樣的結果也就不奇怪了。本試驗中散養小豬場大腸埃希菌對Amp、Ctx、Gen的耐藥率與丹麥2009年、2013年屠宰場豬分離大腸埃希菌耐藥率結果相等或接近[9],該國自1999年豬飼料中已禁用抗菌藥物作為促生長劑。

      本次試驗結果表明,該集約化養殖豬場大腸埃希菌的耐藥性已相當嚴重,對檢測的11種抗菌藥物多數具有較高甚至極高的耐藥性。每株細菌至少耐一種抗菌藥物,82.9%的菌株為多重耐藥菌。總共檢測了5類藥物,而5重耐藥菌株的比例達51.4%。

      豬源大腸埃希菌對Amp、Tet、Dox和Sut的耐藥性極高,且較其他抗菌藥物都高;與國內近些年絕大多數的調查類似,如河南、上海和山東豬源大腸埃希菌規模化豬場大腸埃希菌對Amp、Tet和Sut具極高的耐藥性[10-13],河南豬源大腸埃希菌對Dox耐藥率也極高[10-11];歐盟、加拿大等國豬源大腸埃希菌耐藥性檢測表明,其對Amp、Tet、磺胺類的耐藥性雖非極高,但也較其他抗菌藥物都高。其原因與這些抗菌藥物常用有關。

      國內外對豬源大腸埃希菌耐藥性的調查報告較多,多為致仔豬黃痢、白痢或水腫的大腸埃希菌以及屠宰豬大腸埃希菌的耐藥性。對不同生長階段豬源菌耐藥性的調查不多見。目前國內僅見有人對山東、上海和新疆不同生長階段豬源大腸埃希菌對不同抗菌藥物的耐藥性進行調查[12,14-15]。其結果與我們不盡一致,這應與使用的抗菌藥物不同有關。

      本調查的集約化豬源菌耐藥多樣性大,35株細菌有17種耐藥譜。從有限的結果可發現母豬源菌和育肥豬源菌耐藥多樣性大于保育豬源菌,其原因如何,有待進一步研究。

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